(1)创伤植株感染法创伤植株感染法,是指把新鲜培养的根瘤土壤农杆菌接种在植物的伤口部位,从而诱发肿瘤形成,此方法的关键是必须在植株上形成新的伤口,并使用生活力强的细菌培养物。造成伤口的方法有很多,如刀切、针刺和切除植株幼嫩枝的顶部。吴乃虎等(1989)利用onc+质粒载体和onc-质粒载体实现了外源基因的转移。
(2)原生质体共培养法原生质体共培养法,是指将刚刚再生出的新细胞的原生质体与农杆菌作短暂的共同培养,以促使植物细胞发生转化的方法。应用这种方法转化植物细胞,可以根据特定的抗生素抗性或植物激素自养性快速地鉴定出来,其转化频率可高达5%,由于转化似乎是从单细胞或双细胞阶段发生的,因此转化愈伤组织绝大部分从一开始就是单克隆的,在大多数情况下无需附加进行单细胞克隆这一步。此法的优点在于可以从同一转化细胞产生出一批遗传上同一的转基因植物体。它的缺点是只有活性非常高的健康的原生质体才能共培养转化,因此该法适用于为数不多的几种植物。
(3)叶盘法叶盘法(1eaf disc transformation)是一种简单易行的植物细胞转化、选择与再生的方法,1985年由R.B.Htorsch等人发明,也是目前植物转基因应用最广泛的方法。
具体的做法是先将植物材料如番茄叶子表面消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器在叶上打出直径1~1.5 crfl的圆片,即叶盘(1ear disc),放在农杆菌培养液中浸泡2~3 min,然后用滤纸吸干,叶盘背面向下在铺有灭菌滤纸的培养基上共培养2 d,使农杆菌继续侵染叶盘细胞,以提高转化率。2 d后,将叶盘转移到含有适当抗生素的培养基上培养,经过1~2周后,叶盘周围会长出愈伤组织,然后将愈伤组织转移到生芽培养基(shooting medium)上,进行筛选与再生,接着再转移到生根培养基(rooting medium)上诱导生根,使之发育成完整植株,最后将小植株移栽到土壤中。通过对幼苗进一步检测(如胭脂碱、Southern吸印法、Northem吸印法、Western吸印法等)可以确定植株细胞基因组中是否含有外源基因及外源基因的表达情况。
叶盘法的优点是操作简便,适用性广。对于那些能被农杆菌感染并能从离体叶盘形成愈伤、再生成完整植株的各种植物都适用,尤其是双子叶植物转化效果好。此法具有良好的重复性,便于大量常规地培养转化植株,已成为双子叶植物外源基因导人的主要手段。目前,用这种方法所得的转化体,其外源基因能稳定地遗传和表达,并按照孟德尔遗传规律方式分离。
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