本书基于作者对多种常见典型微生物被膜形成的研究，对微生物被膜的定义与形成、表型、基因组学、相关基因的检测、耐药性、形成的影响条件、形成过程的调控机制、成熟与分散脱落的分子调控，以及抑制清除与安全控制等进行详细阐述，以期为读者了解和研究微生物被膜作出详尽、全面的介绍和分析。 本书适合从事微生物和相关领域学习与研究的学生、科研人员参考使用，亦适合从事微生物相关药物研究的专业技术工作者参考阅读。

第一章微生物被膜概述
　　1.1微生物被膜的定义
　　微生物被膜（microbial biofilm），是微生物*重要的存在形式。自然界中，超过90%的微生物以微生物被膜形式存在，由其引起的人类感染性疾病与食品加工污染分别占65%与80%[1-3]。微生物被膜是微生物在生长过程中为抵抗外界不良环境而相互黏附或黏附于惰性或活性实体表面，同时分泌多糖基质（藻酸盐多糖）、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包裹于其中而形成的一种聚集有大量微生物群体的膜状结构，是微生物的一种特殊生存方式[2，3]。通过采取这种生长方式，与浮游细菌相比，微生物被膜具有多种优势，例如，微生物在形成该状态后，对外界环境的压力（如抗生素、消毒剂、紫外线等）的抵抗能力显著增强；具有更高的耐药性及耐压基因水平传播速率。研究表明，形成微生物被膜后，微生物耐药性可提高100～1000倍。可见，微生物被膜对微生物感染性疾病的治疗与食品工业中的污染的治理造成影响[2，3]。
　　1.2微生物被膜的形成
　　Costerton等在1999年*早对微生物被膜进行阐述，认为被膜的整个结构可分为游离菌、表层菌和里层菌；游离菌代谢比较活跃，菌体较大；而里层菌被包裹于多糖中，代谢率较低，多处于休眠状态，一般不进行频繁分裂，菌体较小。微生物被膜中的多糖主要是细胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）和多聚N-乙酰葡萄糖胺[2-4]。同时，微生物被膜具有独*的三维结构（图1-1），包括内里的细胞及其分泌的黏性物质和胞外多糖，并具有原始的循环系统特征[3-5]。
　　微生物被膜形成的分子调控与安全控制
　　以金黄色葡萄球菌为例，其微生物被膜的形成是通过两步实现的，包括初始的细菌黏附于表面和后续的微生物被膜形成。后者包括细菌增殖、内部菌体粘连以及胞外多糖分泌等过程。
　　在第一阶段，金黄色葡萄球菌黏附于接触表面，是微生物被膜形成的*基本条件。早期研究集中于该阶段的表型影响因素，如细菌的疏水性、外膜蛋白、表面电荷和结构、接触材料特性、微生物生长特性及外环境因子（pH、温度、流体流速等）等。第二阶段是微生物被膜的形成。该阶段包括三个步骤，首先是细菌增殖；然后是膜内菌体粘连，并在固体表面移动、扩展；*后是胞外多聚物（extracellular polymeric substance，EPS）的形成，形成微菌落。在形成微菌落后，细菌对抗生素和紫外线的抗性、遗传交换效率、降解大分子物质的能力及二级代谢产物的产率得到不同程度的提高。一旦菌体大量分泌胞外多糖，将很快形成由多糖包围的微生物被膜；成熟微生物被膜结构是不均匀的，在微菌落间围绕着输水通道，可以运送养料、酶、代谢产物和排出废物等[1，2]。Shirtliff和Leid认为，在微生物被膜内的微菌落是高度有组织的细菌群体，细菌与细菌之间通过群体感应（quorum sensing）作用进行信息交流[1]。细菌的生长状态从浮游状态到形成微生物被膜，是一个从低密度到高密度、从无组织状态到有组织状态的过程，其中涉及一系列基因的开启或关闭。
　　因此，微生物被膜形成的动态过程，包括不同种属及不同株微生物间的差异，不同时间与空间的菌体状态，以及多种微生物共同形成的复合微生物被膜，均决定了微生物被膜的状态与特性。后续章节，将着眼于微生物被膜的形成过程，基于作者前期对多种常见典型微生物的微生物被膜形成的研究，如对几种重要的超级细菌与典型食源性微生物如沙门氏菌、阪崎肠杆菌等的微生物被膜形成过程中的表型及基因组等的研究，结合生物信息学与微生物组学分析对微生物被膜形成分子调控机制，微生物被膜中的群体微生物，微生物被膜的抑制清除与安全控制理论等方面展开详细叙述。
　　第二章微生物被膜表型
　　2.1概述
　　在自然环境和食品工业中，微生物存在方式可分为游离态和生物被膜态，后者是大多微生物存在的主要方式。微生物被膜是微生物附着在表面（活体或非活体表面），借助自身分泌的胞外多糖和细胞外基质，将大量细胞聚集在内的具有复杂立体结构的动态群体生长方式[1]。不同于普通游离状态，微生物被膜中的微生物因其被包裹和外层存在多糖基质，对外界环境的压力（如抗生素、消毒剂、紫外线等）的抵抗能力显著增强，给人类公共卫生和食品安全带来极大的威胁。因此，微生物被膜对食品工业安全及由其引起的细菌性感染治疗造成了一定的影响或困难[2，3]。
　　随着研究方法的发展和多学科领域的交叉与拓宽，在过去的几十年中，微生物被膜的定量和定性的研究方法也越来越成熟。这些方法根据原理大致可分为三大类：①基于微生物被膜胞外基质和微生物被膜内的总细胞数量（包括活细胞和死细胞）的定量试验；②基于活细胞的活菌计数试验；③基于微生物被膜胞外基质成分的定量试验。在相关研究中，对微生物被膜的结构、活性，以及细菌组成动态变化规律等方面的研究取得了很大的进展。
　　微生物被膜定性研究方法主要借助各种染色法（如银染法）、光学和光谱学方法（如光学显微镜和电子显微镜技术等）等进行微生物被膜检查与监测，如MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]/XTT{3，3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠}染色法、二乙酸荧光素（FDA）试验等。而微生物被膜定量的研究方法则包括琼脂平板菌落计数法、结晶紫染色法、1，9-二甲基亚甲蓝（DMMB）试验等。
　　2.2微生物被膜总量
　　2.2.1CV染色法检测原理
　　目前对微生物被膜总量进行检测的方法主要包括结晶紫（crystal violet，CV）染色法及SYTO9/碘化丙啶（PI）染色法[4]。CV染色法由Christensen等在1985年第一次描述，随后经过不断改进得以应用于微生物被膜的定量研究[5]。该法利用结晶紫染料与带负电荷分子结合，可以染细胞和胞外多聚物（extracellular polymeric substance，EPS），*后根据吸光度测定微生物被膜总量。由于细胞（包括活细胞、死细胞）和各种基质都可以被染色，故CV染色法被认定是评估微生物被膜的总量的基本染色方法。Pitts等的研究表明CV染色法在测定细菌微生物被膜生物量上具有一定优势，但较难应用于分析微生物被膜形成的分子调控与安全控制微生物被膜的内在功能[6]。
　　SYTO9是一种能够对核酸进行染色的荧光染料，它通过被动扩散的方式实现穿过细胞膜与细菌菌体（包括活细胞和死细胞）的DNA结合[7]。由于死细胞的细胞膜通透性改变和碘化丙啶（PI）只能穿过不完整的细胞壁的特点，PI可以进入死细胞实现对死细胞的染色。由于DNA也是胞外基质的一部分，因此可以通过SYTO9与DNA的结合间接反映微生物被膜总生物量的变化规律[8]。
　　2.2.2金黄色葡萄球菌微生物被膜总量的检测
　　2.2.2.1金黄色葡萄球菌微生物被膜形成能力的研究
　　本研究中笔者采用结晶紫染色法对519株金黄色葡萄球菌微生物被膜的形成能力进行研究，具体方法如下：①取37℃、180r/min条件下振荡过夜培养的菌液稀释50～100倍后转至新鲜的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）中再培养3h左右以获得对数生长期的细菌，在600nm可见光下稀释培养液浓度至吸光度为0.001。②将稀释好的培养液按200μL/孔加入无菌96孔板中，37℃静置培养48h。③培养结束后，先用无菌生理盐水冲洗各孔3次，除去杂质和浮游菌，然后用0.01%的无菌结晶紫液染色15min。④染色结束后，用无菌水洗涤2次，*后采用95%的乙醇将结晶紫洗脱下来。⑤移取125μL洗脱液于新的酶标板中，于540nm处用酶标仪测定各孔的吸光度。
　　光密度（opticaldensity，OD）值可以反映细菌微生物被膜在实体表面的黏附程度、积累总量等情况。计算公式如下：临界OD值（ODC）=阴性对照组的平均值（OD0）+3×标准差（SD）相对OD值（SI）=微生物被膜平均OD/ODC当0＜OD≤2ODC，菌株形成少量微生物被膜；当2ODC＜OD≤4ODC，菌株形成中等量微生物被膜；当OD＞4ODC，菌株形成大量微生物被膜。
　　当0＜SI≤2时，菌株微生物被膜形成能力较弱（以“+”表示）；当2＜SI≤4时，则微生物被膜形成能力中等（以“++”表示）；当SI＞4时，表明微生物被膜形成能力强（以“+++”表示）。
　　本研究对519株金黄色葡萄球菌的微生物被膜总量进行定量检测与分析，结果显示（表2-1），519株菌株可在实体表面形成一定量的微生物被膜。其中65.9%（342/519）的菌株可形成少量微生物被膜，26.4%（137/519）的菌株可形成中等量微生物被膜，而7.7%（40/519）的菌株可形成大量微生物被膜。

目录
前言
第一章 微生物被膜概述 1
1.1 微生物被膜的定义 1
1.2 微生物被膜的形成 1
参考文献 2
第二章 微生物被膜表型 3
2.1 概述 3
2.2 微生物被膜总量 3
2.2.1 CV染色法检测原理 3
2.2.2 金黄色葡萄球菌微生物被膜总量的检测 4
2.2.3 铜绿假单胞菌微生物被膜总量的检测 12
2.2.4 阪崎肠杆菌微生物被膜总量的检测 14
2.2.5 肺炎克雷伯菌微生物被膜总量的检测 16
2.2.6 白色念珠菌微生物被膜总量的检测 16
2.3 微生物被膜活性 17
2.3.1 XTT法检测原理 17
2.3.2 金黄色葡萄球菌微生物被膜活性的检测 17
2.3.3 铜绿假单胞菌微生物被膜活性的检测 25
2.3.4 阪崎肠杆菌微生物被膜活性的检测 26
2.3.5 肺炎克雷伯菌微生物被膜活性的检测 27
2.3.6 白色念珠菌微生物被膜活性的检测 27
2.4 微生物被膜基质 27
2.4.1 检测原理 27
2.4.2 主要应用 28
2.5 微生物被膜形态 28
2.5.1 光学显微镜 28
2.5.2 扫描电子显微镜 29
2.5.3 激光扫描共聚焦显微镜 31
2.5.4 原子力显微镜 33
参考文献 33
第三章 微生物被膜的基因组学 36
3.1 概述 36
3.2 基因组对微生物被膜形成的影响 39
3.3 金黄色葡萄球菌 39
3.3.1 金黄色葡萄球菌基因组研究 39
3.3.2 金黄色葡萄球菌微生物被膜相关基因的研究 48
3.4 铜绿假单胞菌 50
3.4.1 铜绿假单胞菌基因组研究 50
3.4.2 铜绿假单胞菌微生物被膜相关基因的研究 55
3.5 恶臭假单胞菌 57
3.5.1 恶臭假单胞菌基因组研究 57
3.5.2 恶臭假单胞菌微生物被膜相关基因的研究 63
3.6 阪崎肠杆菌 68
3.6.1 阪崎肠杆菌基因组研究 68
3.6.2 阪崎肠杆菌微生物被膜相关基因的研究 70
3.7 乳杆菌 71
3.7.1 乳杆菌基因组研究 71
3.7.2 乳杆菌微生物被膜相关基因的研究 75
3.8 片球菌 76
3.8.1 片球菌基因组研究 76
3.8.2 片球菌微生物被膜相关基因的研究 78
3.9 蜡样芽孢杆菌 79
3.9.1 蜡样芽孢杆菌基因组研究 79
3.9.2 蜡样芽孢杆菌微生物被膜相关基因的研究 88
3.10 苏云金芽孢杆菌 88
3.10.1 苏云金芽孢杆菌基因组研究 88
3.10.2 苏云金芽孢杆菌微生物被膜相关基因的研究 93
参考文献 94
第四章 微生物被膜相关基因的检测 98
4.1 概述 98
4.2 基因检测方法 99
4.2.1 PCR 99
4.2.2 实时荧光定量PCR 99
4.2.3 滚环扩增技术 100
4.2.4 环介导等温扩增技术 102
4.2.5 重组酶聚合酶扩增技术 105
4.2.6 交叉引物扩增技术 106
4.2.7 聚合酶螺旋反应 107
4.2.8 传感器 109
4.3 金黄色葡萄球菌微生物被膜相关基因的检测 113
4.3.1 金黄色葡萄球菌微生物被膜相关基因型分析 113
4.3.2 基因组岛SCCmec与微生物被膜基因型的相关性 118
参考文献 126
第五章 微生物被膜与耐药性 128
5.1 概述 128
5.2 微生物被膜引起耐药的主要机制 128
5.3 金黄色葡萄球菌 130
5.3.1 金黄色葡萄球菌的耐药性 130
5.3.2 金黄色葡萄球菌微生物被膜与耐药性的相关性 131
5.4 铜绿假单胞菌 132
5.4.1 铜绿假单胞菌的耐药性 132
5.4.2 铜绿假单胞菌微生物被膜与耐药性的相关性 133
5.5 肺炎克雷伯菌 133
5.5.1 肺炎克雷伯菌的耐药性 133
5.5.2 肺炎克雷伯菌微生物被膜与耐药性的相关性 134
5.6 大肠杆菌与其他肠杆菌 134
5.6.1 大肠杆菌与其他肠杆菌的耐药性 134
5.6.2 大肠杆菌微生物被膜与耐药性的相关性 135
5.6.3 其他肠杆菌微生物被膜与耐药性的相关性 135
5.7 肠球菌 135
5.7.1 肠球菌的耐药性 135
5.7.2 肠球菌微生物被膜与耐药性的相关性 136
5.8 链球菌 136
5.8.1 链球菌的耐药性 136
5.8.2 链球菌微生物被膜与耐药性的相关性 136
5.9 鲍曼不动杆菌 137
5.9.1 鲍曼不动杆菌的耐药性 137
5.9.2 鲍曼不动杆菌微生物被膜与耐药性的相关性 137
参考文献 137
第六章 微生物被膜形成的影响条件 139
6.1 概述 139
6.2 微生物被膜形成的条件与影响因素 140
6.2.1 物理因素 141
6.2.2 化学因素 142
6.2.3 生物因素 145
参考文献 150
第七章 微生物被膜形成过程的调控机制 153
7.1 金黄色葡萄球菌微生物被膜形成过程的分子调控 153
7.1.1 抗生素胁迫条件对金黄色葡萄球菌微生物被膜总量的影响 153
7.1.2 抗生素胁迫条件对金黄色葡萄球菌微生物被膜活性的影响 156
7.1.3 亚致死浓度抗生素促进微生物被膜形成的转录组研究 156
7.1.4 被膜基因及TCS基因表达量的变化 169
7.2 阪崎肠杆菌微生物被膜形成过程的分子调控 176
7.2.1 概述 176
7.2.2 阪崎肠杆菌微生物转录组学研究 176
7.3 荧光假单胞菌微生物被膜形成过程的分子调控 182
7.3.1 概述 182
7.3.2 荧光假单胞菌的微生物被膜形成 183
7.3.3 荧光假单胞菌群体感应LuxI/LuxR对微生物被膜形成的影响 185
7.3.4 转录组学分析LuxI/LuxR对荧光假单胞菌微生物被膜的调控 189
7.3.5 小结 196
7.4 希瓦氏菌微生物被膜形成过程的分子调控 196
7.4.1 概述 196
7.4.2 希瓦氏菌的微生物被膜形成特点 196
7.4.3 希瓦氏菌黏附因子在微生物被膜形成中的作用 197
7.4.4 群体感应LuxR蛋白结构及其对希瓦氏菌微生物被膜形成的影响 198
7.4.5 环二肽信号对希瓦氏菌微生物被膜的调控 199
7.4.6 AI-2/LuxS对希瓦氏菌微生物被膜的影响 205
7.4.7 小结 207
参考文献 208
第八章 微生物被膜成熟与分散脱落的分子调控 212
8.1 概述 212
8.1.1 微生物被膜的特征 212
8.1.2 微生物被膜与食品安全 212
8.2 葡萄球菌微生物被膜成熟与分散脱落的分子调控模型分析 213
8.2.1 概述 213
8.2.2 葡萄球菌微生物被膜模型 214
8.2.3 微阵列技术分析基因表达谱 216
8.2.4 荧光定量PCR精确定量 218
8.2.5 微生物被膜中黏附与脱落菌体基因调控的分析 222
8.3 小结 223
参考文献 224
第九章 微生物被膜的抑制清除与安全控制 225
9.1 食品添加剂柠檬酸钠和肉桂醛对微生物被膜的抑制清除 225
9.1.1 概述 225
9.1.2 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌微生物被膜形成能力 226
9.1.3 食品添加剂柠檬酸钠和肉桂醛对微生物被膜的*低抑菌浓度及杀菌浓度 227
9.1.4 食品添加剂柠檬酸钠对金黄色葡萄球菌微生物被膜抑制作用的显微镜观察 228
9.1.5 亚抑菌浓度柠檬酸钠和肉桂醛对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌微生物被膜的影响 230
9.1.6 小结 232
9.2 右旋龙脑和溶菌酶对微生物被膜的抑制清除 233
9.2.1 右旋龙脑和溶菌酶质量浓度对金黄色葡萄球菌被膜的影响 234
9.2.2 右旋龙脑和溶菌酶作用时间对金黄色葡萄球菌被膜的影响 235
9.2.3 单独及联合方法对金黄色葡萄球菌黏附的抑制作用 236
9.2.4 单独及联合方法对金黄色葡萄球菌被膜形成的抑制作用 237
9.2.5 单独及联合方法对金黄色葡萄球菌被膜成熟及分化的抑制作用 239
9.2.6 光学显微镜对微生物被膜的观察 240
9.2.7 扫描电镜对微生物被膜的观察 240
参考文献 241