第1章构建小插入片段和大插入片段的宏基因组文库
　　卡罗拉 西蒙（Carola Simon），罗尔夫 丹尼尔（Rolf Daniel）
　　摘要
　　地球上的生物多样性绝大部分隐藏在未被培养和鉴定的微生物基因组中。构建宏基因组文库这种不依赖微生物培养的方法可以用于发现这些尚未得到探索的遗传学宝藏。通过对来自不同环境的宏基因组文库进行基于功能或序列的筛查，人们发现、鉴定了大量新的生物催化剂。本章将介绍用环境DNA构建小片段宏基因组文库和以质粒和F黏粒作为载体构建大片段宏基因组文库的详细流程。
　　关键词
　　宏基因组DNA、小片段文库、大片段文库、质粒、F黏粒、全基因组扩增
　　1.1介绍
　　实践证明，使用从环境样本中直接提取的DNA构建宏基因组文库并加以筛查是一种可被用于发现有重要生物技术价值的新生物分子的强大工具[1，2]。从原理上看，宏基因组文库让我们可以获取一个生态环境中的所有基因信息[3，4]。构建宏基因组文库的一些步骤与对单一微生物的基因组DNA进行基因克隆的步骤相同，包括用限制性酶切或剪切将环境DNA打断成较小的片段，将它们插入适用的载体系统，以及将重组后的载体转入合适的宿主中，在大多数的研究中，这种构建宏基因组文库的宿主都是大肠杆菌[4]。
　　尽管构建宏基因组文库的概念很简单，但因为大多数宏基因组样本，如从土壤、沉积物中取得的样本生物类群规模庞大，构建良好覆盖宏基因组所必需的数量巨大的克隆则是一项巨大的技术挑战[4，5]。根据插入片段的平均长度不同，基因文库可以分为两种：构建在质粒中的小片段文库（长度小于10kb），构建在F黏粒、黏粒（长度可达40kb）和细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）（长度大于40kb）载体中的大片段文库。选择哪类载体系统用于文库构建取决于环境DNA的质量、期望的插入片段平均长度、所需的文库拷贝数、载体宿主和拟使用的筛查策略[3，5]。纯化后仍含有腐殖质或基质成分污染的环境DNA或在纯化过程中发生了降解、断裂的DNA只适用于构建小片段文库[3]。小片段宏基因组文库对于分离编码未知生物分子的单个基因和小型操纵子非常适用，而当鉴别由大基因簇编码的复杂通路，或鉴定决定未被培养微生物某些遗传特征的DNA大片段时采用大片段文库则是更合适的方法。在此，我们分别描述了一种构建小片段文库的方法和一种构建大片段F黏粒文库的方法。两种方法都被证明适用于克隆从多种环境样本中纯化出的DNA，包括从土壤、深海热泉、冰和人体中提取的样本[6-9]。
　　1.2实验材料
　　1.2.1宏基因组DNA
　　利用环境样本构建宏基因组文库和克隆功能基因依赖所提取DNA的质量，因为文库构建过程中的酶促反应对很多生物或非生物成分的污染都很敏感。尤其是构建大片段文库时必须使用高分子量环境DNA。文库构建需使用至少5～10μg经过纯化的环境DNA。
　　1.2.2小片段文库构建
　　1.Illustra GenomiPhi V2DNA扩增试剂盒[通用电气医疗集团（GEHealthcare），德国慕尼黑]。
　　2.phi29DNA聚合酶（10U/μL）和10×反应缓冲液[富酶泰斯生物技术公司（Fermentas），德国圣莱昂-罗特]。
　　3.S1核酸酶（100U/μL）和5×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　4.DNA聚合酶Ⅰ（10U/μL）和10×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　5.雾化器
　　[英杰公司（Invitrogen），德国卡尔斯鲁厄]。
　　6.打断缓冲液：
　　10mmol/LTris-HCl（pH7.5）、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、10%（m/V）甘油，室温存储。
　　7.Biozym Plaque GeneticPure低熔点琼脂糖[百因美科学股份有限公司（Biozym Scientific GmbH），德国黑西施奥尔登多夫]。
　　8.50×TAE（三乙酸乙二胺四乙酸，Tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acid）缓冲液：242gTris-碱、57.1mL乙酸、100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加H2O至1L，室温存储。
　　9.GELase琼脂糖凝胶消化试剂盒（EPICENTRE生物技术公司，美国威斯康星州麦迪逊）。
　　10.3mol/L乙酸钠（pH5.0）。
　　11.5mol/LNH4OAc（pH7.0）。
　　12.T4DNA聚合酶（5U/μL）（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　13.10mmol/LdNTP混合物（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　14.克列诺（Klenow）片段（10U/μL）（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　15.10×缓冲液O（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　16.SureCleanPlus核酸纯化试剂盒（Bioline公司，德国卢肯瓦尔德）。
　　17.TaqDNA聚合酶和含(NH4)2SO4的10×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。
　　18.25mmol/LMgCl2。
　　19.100mmol/LdATP。
　　20.热敏磷酸酶和
　　10×反应缓冲液[纽英伦生物技术公司（New England Biolabs），美国马萨诸塞州伊普斯威奇]。
　　21.TOPO.XLPCR克隆试剂盒（Invitrogen公司，德国卡尔斯鲁厄）。
　　22.Bio-RadGenePulserII电转仪[伯乐公司（Bio-Rad），德国慕尼黑]。
　　23.卡那霉素母液：25mg/mLH2O，过滤灭菌并存储于–20℃。
　　24.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）母液：24mg/mL溶于H2O，过滤灭菌，每管2mL分装并存储于–20℃。
　　25.5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）母液：20mg/mL溶于N，N.-二甲基甲酰胺（DMF），过滤灭菌并存储于–20℃。
　　26.LB（lysogenybroth）固体培养基：10gNaCl、10g蛋白胨、5g酵母提取物，溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.2，再加入15g琼脂，高温灭菌。
　　27.含50μg/mL卡那霉素、48μg/mLIPTG和40μg/mLX-Gal的LB固体培养基：在500mL灭菌后尚未凝固的LB固体培养基中加入卡那霉素母液、IPTG母液和X-Gal母液各1mL。
　　1.2.3大片段文库构建
　　1.CopyControl.F黏粒文库构建试剂盒（EPICENTRE生物技术公司，美国威斯康星州麦迪逊），按生产商指示存储。
　　2.Biozym Plaque GeneticPure低熔点琼脂糖（Biozym Scientific股份有限公司，德国黑西施奥尔登多夫）。
　　3.Biometra Rotaphor脉冲场电泳仪（Biometra公司，德国哥廷根）。
　　4.5×TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液：54gTris-碱、27.5g硼酸、20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加H2O至1L，室温存储。
　　5.SureClean核酸纯化试剂盒（Bioline公司，德国卢肯瓦尔德）。
　　6.含10mmol/LMgSO4的LB培养基。
　　7.氯霉素母液：氯霉素按6.25mg/mL的浓度溶于乙醇，–20℃存储。
　　8.含12.5μg/mL氯霉素的LB固态培养基：在500mL灭菌后尚未凝固的LB固体培养基中加入1mL氯霉素母液。
　　9.3mol/L乙酸钠（pH7.0），室温存储。
　　10.噬菌体稀释缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.3）、100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2，室温存储。
　　1.3实验方法
　　文库构建由数个独立步骤组成。为了能够成功地克隆环境DNA，在不同步骤之间*好不要长期存储中间产物。如果无法避免，每个步骤完成后可将纯化后的DNA置于4℃存放几天。在开始进行质粒文库构建的DNA末端修复（参见1.3.1.5节）或F黏粒文库构建的片段长度分选（参见1.3.2.3节）之前，DNA可在–20℃存储。但是，在末端修复或片段长度分选之后，DNA不能在–20℃存储，因为反复冻融会损伤DNA链。另外，应该避免对样品DNA进行无必要的移液或吹打。只要试剂能够加入到DNA所在的容器中，就尽量不要移动DNA。当DNA必须要转移到新的离心管中时，使用大口径吸管或切掉枪头尖端以避免进一步打断DNA。
　　在完成每个步骤之后都要测量DNA浓度，以保证还有足够高的DNA浓度来完成后续步骤。因为DNA在各个步骤中会不断损失，在开始实验时*好使用足够多的DNA。在构建小片段文库时，如果可用的环境DNA总量小于5μg，可以先进行全基因组扩增（wholegenomeamplification，WGA）。可以用一种*近发表的方法[10]解开WGA时产生的超分支结构，从而提高克隆效率并避免异常的插入片段长度分布。
　　1.3.1.1节至
　　1.3.1.3节给出了一种对环境DNA进行WGA并解开产物超分支结构的方法。而当环境DNA的总量足够时，可以直接从1.3.1.4节开始构建宏基因组文库。
　　1.3.1小片段宏基因组文库构建
　　1.3.1.1环境DNA的全基因组扩增
　　1.按照试剂盒生产商给出的操作说明对环境DNA进行全基因组扩增，如使用Illustra GenomiPhiV2DNA扩增试剂盒[11]。
　　2.按照操作说明用
　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化DNA[12]。干燥DNA沉淀的时间不要超过5～10min。
　　3.在30μLH2O中溶解DNA沉淀（见注释1）。
　　1.3.1.2解开超分支DNA结构（见注释2）
　　1.将下列组分加入一个灭菌离心管中：1.3.1.1节步骤3所述的经过扩增和纯化的DNA，5μL10mmol/LdNTP混合物，5μL10×phi29缓冲液，1μLphi29DNA聚合酶（10U/μL），加入H2O至总体积为50μL。这一反应混合液可以按照需要等比例放大。
　　2.30℃孵育2h。
　　3.65℃孵育3min使酶失活。
　　4.使用
　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化DNA（参见1.3.1.1节步骤2和步骤3）。
　　1.3.1.3S1核酸酶处理（见注释2）
　　1.按以下比例建立反应体系：1.3.1.2节步骤4得到的全部产物，10μL5×S1核酸酶缓冲液，2μLS1核酸酶（100U/μL）。
　　2.37℃孵育30min。
　　3.使用
　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化产物DNA（参见1.3.1.1节步骤2和步骤3）。
　　1.3.1.4打断宏基因组DNA
　　1.将1～2μL上一步得到的DNA在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。如果超过50%的DNA片段符合预期大小，则直接从1.3.1.5节开始操作。
　　2.按照操作说明组装雾化器。
　　3.将10～15μg环境DNA加至750μL打断缓冲液中，然后移液到雾化器瓶底（见注释3）。
　　4.拧紧雾化器的盖子并将其置于冰上，保持DNA处于低温状态。
　　5.将雾化器连接到压缩气源并用9～10psi①的气压打断10～15s，得到3～8kb长度的DNA片段。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，确定DNA已被充分打断且超过50%的DNA片段达到预期大小。可以通过调整打断气压或者打断时间来调整DNA片段的大小。
　　6.将DNA转移至两个无菌离心管中。
　　①1psi=6.89476×103Pa，全书同。
　　7.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.0）和2.5倍体积的96%乙醇沉淀DNA。轻柔混匀后将DNA置于冰上20min，之后用最高转速于4℃离心30min。
　　8.弃上清，并用70%冷乙醇清洗沉淀两次。第二次清洗后小心