科学家和育种家研究和实际利用单倍体的首要条件之一是能够进行单倍体的鉴定,因此单倍体的鉴定技术也是单倍体育种中的关键技术之一。众所周知,玉米单倍体为一倍体,只有一组染色体(n=10),在植株形态上表现为明显矮小,绝大部分单倍体雄花是高度不育的,只是在少数情况下,单倍体的雄穗会自发产生全部或局部二倍化。早期的时候人们都是通过田间植株形态及育性来判断植株的倍性。但是由于单倍体的频率很低,并且这种方法只有将种子种到田间才能进行判断,人们又通过将一定的遗传标记导入诱导系中,从而可以在子粒上就能进行判断是否为单倍体。目前,国内外各育种单位鉴定单倍体的方法主要是依靠子粒颜色标记的表达。但是这种方法仍不十分理想,因为很多材料的标记表达很弱,这样就导致鉴定效率很低。因此,人们又探索了其他的一些方法,如油分鉴定法、分子标记鉴定法等。此外,即使材料的标记表达非常清楚,目前单倍体的鉴定仍然靠人工鉴定,这是一件非常费时费力的事情,因此如何机械化鉴定单倍体也是今后努力的方向。
尽管目前常用的方法是遗传标记法,这里仍将可能用于单倍体鉴定的各种方法进行简单介绍,供大家参考,以期探索出更为有效的方法,从而提高单倍体的鉴定效率。
第一节细胞遗传学方法
确定倍性最基本和最精确的方法是鉴定植物体细胞或减数分裂细胞中的染色体数目。这种分析可以查明诸如整倍单倍体和非整倍单倍体,以及在单倍体中自发二倍化的程度和由此引起的组织混倍性。染色体计数通常用临时制片经醋酸洋红、苏木精或其他染料染色后进行。
幼嫩的根尖具有大量的分裂旺盛的细胞,是染色体计数的良好材料。针对不同繁殖方式的植物,可以采用不同的方式快速获得幼根。无性繁殖植物可以用扦插刺激根的形成。对于利用种子繁殖的植物,采用毛巾发芽法或者专用的发芽纸进行发根是非常有效的,在其上可以找到足够数量的旺盛生长着的根尖。染色体计数过程中,常以中期染色体为研究对象,但在整个细胞分裂周期中,中期细胞数目较少,且染色体因纺锤丝的牵连而紧密地排列在赤道板上,造成染色体计数及识别的困难。在根尖固定之前进行预处理可以改变细胞质的黏度,破坏和抑制纺锤体的形成,有效地积累中期细胞,弥补正常条件下分裂相较少的不足,使染色体适度缩短,并有利于分散。
对某些物种(番茄、甜菜),为了寻找分裂细胞,可以利用幼嫩的小叶子。如果在生长早期,在这些小叶中观察不到倍数性的特征,那么可以在开花期,在花粉母细胞减数分裂时按胚胎学方法进行鉴定。
利用细胞光度计法分析细胞核中DNA含量同样是十分精硫的,但其工作性能暂时不能可靠地区分整倍单倍体和非整倍单倍体。如果组织中由于某种原因缺少分裂细胞(例如在分化后或受极端影响后),采用细胞光度计法是适宜的。该方法曾成功地用来鉴定天竺葵和烟草单倍体在组织培养中不同组织的倍性。
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