童光志，博士，研究员，博士生导师。1962年10月出生于湖北省蕲春县。曾担任哈尔滨市政协常委、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所副所长、兽医生物技术国家重点实验室主任、中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术分会理事长等职务。现为中国农业科学院上海兽医研究所所长，国务院政府特殊津贴获得者，首批入选“百千万人才工程”和农业部“神农计划”提名人，中国农业科学院跨世纪学术带头人，农业部有突出贡献中青年专家，首届全国优秀农业科技工作者，973“动物重大传染病病原变异与致病的分子机制”项目首席科学家，863计划生物与现代农业领域基因操作主题专家组成员。多年来一直从事动物病毒分子生物学与基因工程研究工作。曾获国家科技进步奖、国家发明奖、黑龙江省自然科学奖、省部级科技进步奖等奖项10项。
　　王云峰，博士，研究员，博士生导师。1967年3月出生于江苏省东台县。现任兽医生物技术国家重点实验室副主任、中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术分会秘书长。“新世纪百千万人才国家级人选”、黑龙江省优秀中青年专家。多年来从事畜禽病毒载体疫苗的研究工作。曾获国家科技进步奖、国家发明奖、省部级科技进步奖等奖项6项。

　　《动物基因工程疫苗原理与方法》专著受华夏英才基金资助出版，为“十一五”国家重点图书。书中论述了基因工程疫苗领域的最新研制成果及正在研制开发的基因工程疫苗，包括亚单位疫苗、转基因植物疫苗、病毒基因缺失疫苗、病毒活载体疫苗、细菌性载体疫苗、核酸疫苗等。详细介绍了动物基因工程疫苗设计的原则、基因工程疫苗原理与方法、免疫效果评价等方面内容。在介绍基础理论的同时，强调技术实用性，内容系统全面。
　　《动物基因工程疫苗原理与方法》适合高校生物工程、生物制药、动物医学、生物技术等专业师生及科研人员阅读参考，并且是生物制药企业开发新型疫苗的良好指导用书。

　　6．9．1国际畜禽基因工程疫苗产业化现状
　　目前，在动物疫苗及诊断试剂的产业化运作方面，国际通行的惯例是研究机构与制药企业联合发展。疫苗和诊断试剂产业发展的源头集中在科研机构及生物制品生产公司中的研发中心，研究机构通过技术转让的方式，将研究成果直接转让给疫苗及诊断试剂的生产机构；而疫苗及诊断试剂的生产和推广则集中各大公司。这种组合方式加快了新成果转化的进程，提高了成果转化的速度和效率。具体到疫苗和诊断试剂的研制上，发达国家采取的策略是：限制致弱活病毒疫苗的使用，优先发展灭活疫苗、亚单位疫苗，并采用基因工程技术开发新型疫苗，而且新型疫苗的研究已经成为发达国家在该领域内的异常活跃的研究方向。美国利用基因工程技术研制成功的兽用疫苗主要有幼畜腹泻疫苗、口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗和禽痘病毒活载体疫苗等。在2000年的药品市场上，疫苗所占份额最大，其中兽用基因工程疫苗占整个基因工程疫苗的市场份额从1991年的20％提高到40％左右。
　　目前，已正式投入生产并广泛应用的基因工程疫苗主要有以下几种：①含狂犬病毒糖蛋白G基因的重组痘苗病毒疫苗已在北美和欧洲广泛应用于预防野生动物的狂犬病；②TK和gE双基因缺失的伪狂犬病病毒弱毒疫苗已在美国和大部分欧盟国家广泛应用于预防猪伪狂犬病，特别是启动猪伪狂犬病根除计划的国家都是使用这种基因缺失疫苗；③TK和gE双基因缺失的牛传染性鼻气管炎病毒疫苗也在许多国家使用，荷兰于1998年5月在全国范围内推广使用TK和gE双基因缺失的疫苗以根除此病；④表达禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗和表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒疫苗也已在美国农业部成功注册，开始产业化生产。此外，还有很多种基因工程疫苗在一定范围内都实现了产业化。值得注意的是一些发达国家由于资金和技术力量比较雄厚，研发的速度较快，他们瞄准的市场是全球，而非一个国家，另外，专利也是他们开发全球市场的重要武器。

第1章 疫苗的历史、发展和前景1
1．1 疫苗概念的产生及其历史1
1．2 疫苗的应用及其效果分析3
1．3 疫苗研究新技术的发展6
1．3．1 传统疫苗7
1．3．2 基因工程疫苗7
1．4 疫苗对消灭和控制动物传染病的发展前景8
参考文献8

第2章 疫苗免疫学基本理论9
2．1 疫苗相关免疫学基础9
2．1．1 免疫系统9
2．1．2 免疫器官9
2．1．3 免疫细胞11
2．1．4 抗原13
2．1．5 抗体15
2．1．6 免疫球蛋白的基本结构和功能16
2．2 免疫应答的基本过程17
2．2．1 非特异性免疫应答17
2．2．2 特异性免疫应答19
2．3 疫苗有效免疫反应的基本要素22
2．3．1 抗原方面的因素22
2．3．2 机体方面的因素22
2．3．3 免疫方法的影响23
2．4 疫苗免疫的主动免疫反应23
2．4．1 抗原提呈23
2．4．2 抗原竞争24
2．4．3 体液免疫和细胞免疫反应的动态变化25
2．4．4 免疫反应的调节25
2．4．5 免疫记忆和免疫促进效应26
2．4．6 全身性免疫、局部免疫和初乳免疫27
2．4．7 被动免疫28
参考文献28

第3章 疫苗佐剂30
3．1 疫苗佐剂的作用机理30
3．1．1 调节免疫30
3．1．2 提呈抗原31
3．1．3 细胞毒性T细胞应答31
3．1．4 储存作用32
3．2 植物佐剂32
3．2．1 皂苷类32
3．2．2 免疫刺激复合物佐剂32
3．2．3 蜂胶佐剂33
3．2．4 香菇多糖34
3．2．5 云芝多糖34
3．2．6 黄芪多糖34
3．3 细菌佐剂35
3．3．1 脂多糖35
3．3．2 胞壁酰二肽及其衍生物35
3．3．3 霍乱毒素35
3．3．4 大肠杆菌不耐热肠毒素36
3．3．5 百日咳毒素36
3．3．6 短小棒状杆菌36
3．3．7 卡介苗37
3．3．8 单磷酰脂质A37
3．4 矿物油佐剂37
3．4．1 油乳剂37
3．4．2 MF59佐剂37
3．5 矿物盐佐剂38
3．5．1 铝佐剂（铝胶）38
3．5．2 磷酸钙佐剂39
3．5．3 氢氧化铁凝胶佐剂40
3．5．4 硒40
3．6 细胞因子佐剂40
3．6．1 白细胞介素141
3．6．2 白细胞介素241
3．6．3 白细胞介素1241
3．6．4 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子41
3．6．5 干扰素42
3．6．6 其他细胞因子42
3．7 核酸佐剂43
3．7．1 免疫刺激序列（CpG基序）43
3．7．2 表达与免疫相关的细胞因子的核酸载体46
3．7．3 双链RNA46
3．8 投递系统47
3．9 新佐剂的选择和研究方向47
参考文献49

第4章 疫苗设计的技术基础51
4．1 经典疫苗及新型疫苗的技术特点51
4．1．1 经典疫苗的技术要点51
4．1．2 新型疫苗的特点52
4．2 当前疫苗研究的趋势52
4．2．1 新型疫苗的分子设计52
4．2．2 新型疫苗的规模化生产53
4．2．3 开发配套的鉴别诊断技术53
4．2．4 新型佐剂的使用53
4．2．5 动物用生物制品工程研究中心建设53
4．3 常规活疫苗的研发原则53
4．3．1 病原自然弱毒株53
4．3．2 异源免疫53
4．3．3 异源动物或细胞传代致弱54
4．3．4 改变体外培养传代环境54
4．4 基因工程疫苗及其研发原则54
4．4．1 亚单位疫苗及其研发原则54
4．4．2 基因缺失疫苗及其研发原则55
4．4．3 活载体疫苗及其研发原则55
4．4．4 核酸疫苗及其研发原则56
4．4．5 合成多肽疫苗及其研发原则58
4．4．6 T细胞疫苗60
4．5 基因工程疫苗设计中优化基因表达的关键因素61
4．5．1 密码子最佳化61
4．5．2 翻译终止效率62
4．5．3 真核细胞中的异源蛋白表达62
4．6 计算机辅助疫苗设计技术63
4．6．1 计算机辅助疫苗设计技术的原理与方法63
4．6．2 计算机辅助疫苗设计技术的应用与常用工具64
4．6．3 计算机辅助疫苗设计的产业前景65
4．7 利用免疫蛋白质组学方法筛选高效疫苗65
4．7．1 免疫蛋白质组学65
4．7．2 免疫蛋白质组学的技术体系66
4．7．3 免疫蛋白质组学在疫苗候选靶位筛选中的应用67
4．7．4 展望67
参考文献68

第5章 疫苗效果的免疫学评价69
5．1 疫苗开发的原则与开发步骤69
5．2 疫苗效果免疫学评价的一般原则69
5．2．1 方法69
5．2．2 安全性70
5．2．3 免疫效果70
5．2．4 保护效果70
5．2．5 流行病学评价70
5．3 疫苗效果的免疫学评价方法70
5．3．1 疫苗免疫效果的实验室评估70
5．3．2 疫苗免疫效果的临床评估73
5．4 疫苗效果的流行病学评价74
5．4．1 传染病的流行与疫苗的作用策略74
5．4．2 传染病的流行及其流行病学特征74
5．4．3 疫苗在控制传染病流行中的作用76
5．4．4 疫苗的免疫策略76
5．4．5 疫苗效果的流行病学指标77
5．4．6 疫苗效果调查的流行病学设计78
参考文献79

第6章 基因工程疫苗概述81
6．1 基因工程疫苗的概念81
6．2 基因工程亚单位疫苗82
6．2．1 细菌性疾病亚单位疫苗82
6．2．2 病毒性疾病亚单位疫苗83
6．2．3 激素亚单位疫苗83
6．3 基因突变疫苗及基因缺失疫苗83
6．4 基因工程活载体疫苗84
6．4．1 复制性活载体疫苗84
6．4．2 非复制性载体疫苗85
6．5 核酸疫苗85
6．6 转基因植物可食疫苗85
6．7 合成肽疫苗86
6．8 抗独特型疫苗87
6．9 畜禽基因工程疫苗产业发展现状与前景87
6．9．1 国际畜禽基因工程疫苗产业化现状88
6．9．2 国内畜禽基因工程疫苗产业化现状88
6．9．3 21世纪面临的机遇、挑战和策略89
参考文献90

第7章 基因工程亚单位疫苗92
7．1 基因工程亚单位疫苗的种类92
7．2 基因工程亚单位疫苗抗原基因的选择93
7．3 基因工程亚单位疫苗的抗原表达系统93
7．3．1 原核表达系统93
7．3．2 酵母表达系统96
7．3．3 昆虫细胞表达系统101
7．3．4 哺乳动物细胞表达系统104
7．4 外源蛋白表达操作案例110
7．4．1 原核表达外源蛋白110
7．4．2 毕赤酵母表达外源蛋白111
7．4．3 昆虫细胞（BactoBac系统）表达外源蛋白114
7．4．4 脂质体法转染真核细胞115
7．5 亚单位疫苗研究与应用115
7．5．1 原核表达系统在亚单位疫苗研究中的应用115
7．5．2 真核表达系统在亚单位疫苗研究中的应用116
7．6 展望117
参考文献117

第8章 转基因植物疫苗119
8．1 植物生物反应器生产可食用疫苗研究进展120
8．1．1 可食用疫苗的表达系统120
8．1．2 可食用疫苗的可行性121
8．2 转基因植物疫苗的载体系统123
8．2．1 外源基因转移的植物病毒载体123
8．2．2 外源基因转移的质粒载体125
8．2．3 载体卡盒130
8．2．4 载体构建中常用的选择标记基因及报告基因131
8．2．5 外源基因的转化方法135
8．2．6 转入基因的状况和表达以及基因沉默145
8．3 转基因植物疫苗的植物受体系统148
8．3．1 植物基因转化受体系统的类型及其特性148
8．3．2 植物基因转化受体系统建立的程序149
8．3．3 植物基因转化受体系统建立中常遇的问题152
8．4 转基因植物操作案例153
8．4．1 根癌农杆菌介导的基因转化方法153
8．4．2 发根农杆菌介导的植物转化161
8．4．3 基因枪轰击法（瞬时表达）163
8．5 转基因植物疫苗存在的问题与对策163
8．5．1 受体植物不理想164
8．5．2 重组抗原蛋白表达量低164
8．5．3 转基因植物疫苗的免疫原性弱164
8．5．4 安全性问题165
8．5．5 植物大量表达外源基因时出现长势弱的现象165
8．5．6 口服时抗原的消化降解165
8．5．7 重组蛋白的提纯165
8．5．8 免疫耐受165
8．6 展望166
参考文献166

第9章 病毒基因缺失疫苗169
9．1 基因缺失疫苗研究概况169
9．2 畜禽基因缺失疫苗制备原理与技术171
9．2．1 疱疹病毒基因缺失疫苗的制备原理和方法171
9．2．2 反转录病毒基因缺失疫苗的制备原理与方法175
9．2．3 RNA病毒基因缺失疫苗的制备原理与方法175
9．3 畜禽基因缺失疫苗的研究与应用现状180
9．3．1 伪狂犬病基因缺失疫苗的研究180
9．3．2 牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗的研究180
9．3．3 马疱疹病毒基因缺失疫苗的研究181
9．3．4 反转录病毒基因缺失疫苗的研究181
9．3．5 RNA病毒基因缺失疫苗的研究181
9．3．6 畜禽基因缺失疫苗的应用现状182
9．4 畜禽基因缺失疫苗的展望182
参考文献183

第10章 病毒活载体疫苗186
10．1 重组病毒活载体疫苗的技术特点186
10．2 重组活载体疫苗的设计原则187
10．2．1 抗原的选择187
10．2．2 活载体的选择187
10．2．3 转移载体的构建188
10．2．4 外源基因插入位点的选择188
10．3 痘病毒载体疫苗188
10．3．1 痘病毒的分子生物学189
10．3．2 痘苗病毒载体疫苗190
10．3．3 禽痘病毒载体疫苗195
10．4 疱疹病毒载体209
10．4．1 伪狂犬病病毒载体疫苗209
10．4．2 1型牛疱疹病毒载体疫苗217
10．4．3 马立克病病毒载体218
10．5 腺病毒223
10．5．1 腺病毒载体的概述223
10．5．2 腺病毒载体的构建225
10．5．3 改进腺病毒载体的方法231
10．5．4 展望234
10．6 反转录病毒235
10．6．1 反转录病毒概述235
10．6．2 反转录病毒载体的包装原理235
10．6．3 反转录病毒载体的分类236
10．6．4 反转录病毒载体的构建238
10．6．5 反转录病毒的优缺点238
10．6．6 近年来反转录病毒载体的改进239
10．6．7 展望240
10．7 甲病毒RNA复制子疫苗241
10．7．1 基本原理和特点241
10．7．2 甲病毒复制子疫苗的优缺点242
10．7．3 甲病毒复制子疫苗的免疫机理242
10．7．4 几种主要的甲病毒RNA复制子243
10．7．5 甲病毒表达载体构建策略246
10．8 重组活载体疫苗的局限性247
10．8．1 安全性247
10．8．2 母源性抗体干扰248
10．8．3 重组病毒的表达量249
10．8．4 病原性及免疫效力249
10．9 重组病毒活载体疫苗的发展方向249
参考文献251

第11章 细菌性载体疫苗256
11．1 沙门菌载体256
11．1．1 鼠伤寒沙门菌菌株特征257
11．1．2 鼠伤寒沙门菌减毒株的构建原理257
11．1．3 重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建及其免疫机制257
11．1．4 重组鼠伤寒沙门菌株的构建方法261
11．1．5 结语264
11．2 重组BCG载体265
11．2．1 重组BCG载体的优点265
11．2．2 重组BCG载体的研究进展265
11．2．3 rBCG诱导的免疫应答及免疫途径对免疫效果的影响268
11．2．4 rBCG存在的一些问题269
11．2．5 重组卡介苗菌株的构建方法269
11．2．6 展望273
11．3 乳酸菌（乳酸杆菌和乳酸乳球菌）载体273
11．3．1 乳酸杆菌载体274
11．3．2 乳酸乳球菌279
11．4 弧菌载体疫苗282
11．4．1 弧菌载体282
11．4．2 适用减毒弧菌的表达系统283
11．4．3 平衡致死质粒的保持283
11．4．4 对细菌载体应用的更多考虑284
11．5 志贺菌载体疫苗285
11．5．1 志贺菌载体285
11．5．2 志贺菌传递质粒DNA285
11．6 李斯特菌载体285
11．6．1 李斯特菌疫苗286
11．6．2 李斯特菌载体286
11．6．3 减毒李斯特菌在肿瘤治疗中的应用286
11．6．4 李斯特菌传递质粒DNA287
11．7 枯草芽孢杆菌整合载体287
11．7．1 芽孢杆菌整合载体的研究历程287
11．7．2 枯草芽孢杆菌整合载体的整合机理及方式288
11．7．3 枯草芽孢杆菌整合载体疫苗的构建289
11．7．4 芽孢杆菌整合载体的应用291
参考文献291

第12章 核酸疫苗294
12．1 DNA疫苗的特点295
12．1．1 DNA疫苗的主要优点295
12．1．2 DNA疫苗的局限性297
12．2 DNA疫苗的免疫应答机制298
12．2．1 从诱导产生的免疫应答类型方面来探讨DNA免疫机制299
12．2．2 从接种途径方面来探讨DNA免疫的机制301
12．3 DNA疫苗的构建与评价303
12．3．1 选择合适的目的基因和载体304
12．3．2 DNA疫苗的构建305
12．3．3 提高抗原蛋白表达量和免疫原性305
12．3．4 验证抗原蛋白的表达情况306
12．3．5 DNA疫苗的免疫学效果评价306
12．3．6 安全性分析307
12．4 提高DNA疫苗免疫效果的策略307
12．4．1 编码抗原的目的基因的改造307
12．4．2 疫苗质粒载体的选择和优化308
12．4．3 基因佐剂309
12．4．4 免疫途径和免疫方法315
12．4．5 DNA疫苗免疫方式的改进317
12．4．6 DNA疫苗的靶向策略318
12．4．7 接种方案321
12．4．8 疫苗剂型的改进322
12．5 DNA疫苗在畜禽疾病控制中的应用研究与发展趋势323
12．5．1 禽的相关DNA疫苗323
12．5．2 猪的相关DNA疫苗325
12．5．3 牛的相关DNA疫苗326
12．5．4 犬的相关DNA疫苗327
12．5．5 细菌病的DNA疫苗327
12．5．6 寄生虫病的DNA疫苗328
12．6 DNA疫苗的安全性问题329
12．6．1 重组质粒能否整合到宿主细胞基因组中导致原癌基因的激活或抑癌基因的抑制329
12．6．2 重组质粒能否诱导自身免疫反应,产生抗DNA抗体330
12．6．3 重组质粒持续表达外源抗原能否产生不良后果330
12．6．4 重组质粒能否具有生殖毒性331
12．6．5 重组质粒与细胞因子合用能否导致其他风险331
12．6．6 DNA疫苗标准化的问题331
12．6．7 风险与效率比332
12．7 结语332
参考文献333

第13章 A型流感病毒反向遗传学操作技术及其在疫苗研制过程中的应用336
13．1 流感病毒的分子生物学336
13．1．1 流感病毒的结构与编码蛋白的功能336
13．1．2 流感病毒的复制339
13．2 流感病毒反向遗传学技术的发展341
13．2．1 借助辅助病毒拯救流感病毒341
13．2．2 由克隆的基因拯救A型流感病毒341
13．3 反向遗传学操作技术在流感病毒疫苗研究中的应用344
13．3．1 弱毒流感疫苗株的拯救344
13．3．2 病毒感染与疫苗免疫动物鉴别诊断344
13．4 流感病毒8质粒系统实验操作方法345
13．4．1 pHW2000双向转录载体345
13．4．2 以pHW2000为载体的病毒拯救346
13．5 展望347
参考文献348

第14章 新城疫病毒的反向遗传操作及其在新型疫苗研制中的应用349
14．1 RNA病毒的反向遗传操作349
14．1．1 概述349
14．1．2 感染性分子克隆的构建350
14．1．3 感染性分子克隆的体外操作352
14．1．4 结语353
14．2 新城疫病毒概述353
14．2．1 新城疫病毒的生物学特性354
14．2．2 新城疫病毒的分子生物学特性357
14．2．3 新城疫的诊断、免疫与防制361
14．3 新城疫病毒的反向遗传操作技术原理及操作363
14．3．1 分子水平构建cDNA等元件364
14．3．2 拯救过程365
14．3．3 验证分析366
14．3．4 操作过程的注意事项367
14．4 反向遗传操作技术在新城疫病毒中的应用367
14．4．1 研究结构和功能的关系367
14．4．2 插入报告基因的重组病毒371
14．4．3 标记疫苗/嵌合疫苗372
14．4．4 禽用载体疫苗373
14．4．5 用于人类传染病预防的疫苗载体374
14．4．6 载体修饰用于肿瘤的治疗376
14．4．7 结语378
参考文献378

第15章 细菌人工染色体技术及其在新型疫苗研制中的应用382
15．1 细菌人工染色体技术的产生382
15．2 细菌人工染色体的结构功能及其遗传特性383
15．3 细菌人工染色体的构建策略及构建方法384
15．3．1 细菌人工染色体的构建策略384
15．3．2 细菌人工染色体的构建方法385
15．4 细菌人工染色体的构建操作案例387
15．4．1 材料387
15．4．2 重组鸡马立克病病毒转移载体的构建387
15．4．3 重组鸡马立克病病毒的获得389
15．4．4 电转化感受态细胞DH10B的制备389
15．4．5 BAC分子克隆化病毒的筛选389
15．4．6 BACDNA拯救重组病毒生长特性的测定390
15．5 细菌人工染色体作为疫苗的应用及探索390
15．6 细菌人工染色体疫苗的修饰系统393
15．6．1 Red/ET重组系统393
15．6．2 Red/ET重组的机制394
15．7 细菌人工染色体疫苗诱导机体免疫应答的机制397
15．8 细菌人工染色体疫苗的优越性及其存在的不足398
15．8．1 细菌人工染色体疫苗的优越性398
15．8．2 细菌人工染色体疫苗存在的问题与对策398
15．9 展望398
参考文献399

第16章 联合免疫400
16．1 概述400
16．2 联合疫苗的历史和发展401
16．3 传统的联合疫苗402
16．4 新型的联合疫苗403
16．5 联合疫苗的制造和使用405
16．6 展望407
参考文献407