3.特异性
原位PCR的特异性是评价该方法是否成功的一个关键参数。液相PCR扩增产物的特异性可用凝胶电泳或Souther印迹鉴定。如用细胞悬液做原位PCR，扩增后可将细胞溶解，同样可采用凝胶电泳或Souther印迹对扩增产物的特异性进行鉴定。但在玻片上进行原位PCR，只有间接法原位PCR可通过原位杂交检出特异性扩增片段，特异性较高，而直接法就较差。原位PCR的非特异性问题主要是较容易出现假阳性。其原因可能是引物与模板错配或在引物延伸过程中三磷酸核苷酸的错误掺入而导致特异性序列扩增；或因细胞内受损DNA的修复而形成的非特异性序列；也可能由于特异性扩增产物弥散出细胞外而附着在邻近的阴性细胞上。在原位扩增时，采取热启动PCR和／或套式PCR，可提高反应的特异性。在引物延伸时，如掺人生物素标记的三磷酸核苷酸。会使合成的新链体积增大，这样可减轻由弥散引起的人工现象。在PCR反应中，用针对同一靶序列不同片段的多对引物进行扩增，这样可得到不同长度的扩增产物，它们互相重叠，像“脚手架”那样交织一起。由此可避免扩增产物被洗脱，有利于扩增序列原位保留，防止弥散。采用多对引物不仅可提高原位PCR的特异性，而且还提高其敏感性。但是当为靶序列设计多对引物有困难时，这一增加反应特异性和敏感性的措施就无法采用了。
三、应用前景
回顾人类可行进步的历史，许多可行的发展是以研究方法与工具的创新为先导的。以病理学为例，自古至今随着尸体解剖、光学显微镜、电子显微镜以及免疫组织化学技术的创立，先后经历了器官病理学、细胞病理学、超微病理学和免疫病理学等几个发展阶段。仅年来，原位杂交和原位PCR的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的学科推进到了分子病理学水平。原位PCR作为一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的形态学研究方法，从一开始就受到病理学专家的青睐。在艾滋病等病毒病因、潜伏性、隐性感染及发病机理的探讨，肿瘤细胞的基因突变、基因重排，良、恶性肿瘤的鉴别，以及对遗传性疾病基因缺陷等的方面，发挥了重要的作用。
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