第一章中医方证代谢组学研究
中药是中医防治疾病的物质基础，也是中医理论及临床实践的有效载体。中药在临床上疗效确切，在新冠肺炎疫情防控中发挥重要作用就是其有效性的现实体现。中药确有疗效，必有其发挥功效的物质基础，在阐明中药临床效应、效应机制基础上，发现与临床疗效关联的药效物质基础是提高临床疗效、建立中药标准、创新药物及国际发展的必由之路。长期以来，囿于天然药物研究模式，以及与中医证候相关联的生物评价体系的严重缺乏，加之单味中药研究模式与临床方剂用药实践相悖，使中药药效成分研究与临床功效严重脱节。从严格意义上讲，大部分中药药效物质基础尚未阐明，严重制约了临床精准用药和建立有效的质量控制体系。因此急需一种新的符合中医理论及临床实践特征的研究方法，使发现的药效物质能与临床功效紧密关联。而方证代谢组学理论和方法的出现，实现了集阐明效应、揭示效应机制及鉴定效应成分于一体的中药有效性研究的新策略，破解了中药药效物质基础研究与临床疗效关联性不强的瓶颈。首先利用代谢组学技术表征证候生物标志物，实现了证候客观诊断，并以证候生物标志物为参数精准评价方剂效应；同时采用一体化研究，以中药血清药物化学方法鉴定方剂有效状态下进入体内的成分；*后，创建数学模型将方剂体内成分动态与证候生物标志物相关联，挖掘与证候生物标志物轨迹变化高度相关的方剂成分，作为药效物质基础并阐明其作用机制，从而形成了中药体内药效物质基础研究的系统方法学，为解决证候生物标志物、质量标志物发现等中药有效性相关的科学问题提供新方法。
第一节 证候/疾病生物标志物发现与表征
证候是中医辨证论治的核心，概括了人体生理病理反应状态。疾病的发生会引起体内代谢产物的变化，代谢组学关注的是机体在经历病理、生理刺激或基因修饰后代谢产物的整体性变化，可对整个代谢网络的低相对分子质量代谢物，特别是特征性潜在生物标志物进行描绘，进行全面、实时、系统的轮廓分析，通过“生化表型”反映生物体的整体功能状态，其全景式、整体互动性的特点与中医学“整体观”“辨证论治”“司外揣内”的思维模式不谋而合。
代谢组学研究方法有助于揭示中医证候及疾病的微观物质基础。金艳涛等[1]探讨艾滋病脾肾亏虚证的血液代谢组学特征，采用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱仪（UPLC/Q-TOF-MS）联用技术检测代谢产物，使用主成分分析（PCA）和偏*小二乘判别分析（PLS-DA），发现艾滋病脾肾亏虚证患者与正常人的血清代谢物在得分图上有明显区分；确定差异代谢物主要是牛磺胆酸、甘氨酸、磷脂酰肌醇、甘氨胆汁酸、牛磺去氧胆酸、鹅去氧胆酸甘氨酸偶联物、葡萄糖苷酸、胆红素等。赵超群等[2]运用代谢组学技术分析乙肝肝硬化患者肝肾阴虚及肝胆湿热两种典型证候（同病异证）的血清差异代谢产物及其代谢通路，采用气相色谱-飞行时间质谱联用技术对乙肝肝硬化患者以及与之相匹配的健康人的血清样本进行检测，采用非监督的主成分分析、有监督的偏*小二乘判别分析及正交偏*小二乘判别分析（OPLS-DA），观察到各组之间代谢谱均有良好的区分，发现肝胆湿热及肝肾阴虚两种典型证候的共同物质10个，去除疾病（隐证）的信息，获得两种证候共同物质6个，涉及的代谢通路为甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢和苯丙氨酸代谢；同时，分别获得两种证候各自特异性的代谢物质各8个，分别涉及亚油酸代谢和甘氨酸、苏氨酸及丝氨酸代谢。发现肝胆湿热及肝肾阴虚不同证候之间既存在病的共同物质（同病），也存在证的差异物质（异证）。杨宇峰等[3]通过非靶标脂质组学分析脾气虚证代谢综合征大鼠血清样本脂质代谢物，运用UPLC/Q-TOF-MS技术检测模型组和正常组生物样本血清的代谢轨迹，采用主成分分析和偏*小二乘判别分析寻找各组代谢物差异，筛选潜在内源性生物标志物。结果发现，潜在生物标志物主要有溶血磷脂酰胆碱、2-羟基丁酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸、花生四烯酸等。揭示脾气虚证代谢综合征大鼠模型存在明显脂质代谢紊乱，游离脂肪酸是脂质代谢中*活跃的成分，这些小分子化合物可能是中医脾气虚证候的微观物质基础。
杨宇峰等[4]运用UPLC/Q-TOF-MS联用技术检测血清代谢轨迹，采用主成分分析和偏*小二乘判别分析筛选潜在内源性生物标志物，寻找代谢综合征痰湿证潜在生物标志物及相关的代谢通路，探讨其内在的生物物质基础。结果发现代谢综合征痰湿证生物模型存在氨基酸代谢、脂质代谢、胆汁酸代谢、氧化应激、磷脂代谢、碳水化合物代谢以及能量代谢紊乱。刘世刚等[5]采用代谢组学方法探索支气管哮喘慢性持续期虚寒证和虚热证患者的小分子代谢物差异，揭示哮喘临床证候分型与小分子代谢物之间的相关性，寻找哮喘证型的潜在生物标志物。支气管哮喘慢性持续期患者与对照组相比，小分子代谢物有显著差异，哮喘虚寒证与虚热证患者相比，小分子代谢物有显著差异，4-氨基丁酸可能是潜在鉴别支气管哮喘慢性持续期虚寒证和虚热证型的生物标志物，哮喘虚寒证组和虚热证组β-丙氨酸代谢通路受到扰动。姜月华等[6]通过检测痰湿壅盛型高血压模型小鼠的血浆代谢组变化，分析挖掘该证候的潜在生物标志物，从整体角度阐释痰湿壅盛型高血压模型小鼠的代谢特征。结果共筛选出差异代谢物125个，差异较大的代谢物依次为磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱等。差异代谢物主要富集于胆碱代谢、GnRH信号通路、氨基酸的合成、FcγR介导的吞噬作用、磷脂酶D信号途径等。磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱可作为痰湿壅盛型高血压小鼠模型的特征血浆代谢标志物。苟小军等[7]研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）肝胆湿热证患者尿液中代谢物的变化，寻找其特征代谢物，采用气相色谱质谱（GC-MS）联用技术检测NAFLD肝胆湿热证患者尿液中小分子代谢产物。获得了12个有显著性差异的代谢物，包括4-硝基苯甲酸酯、异龙脑、1H-吲哚、醋酸、色氨酸、古龙酸、岩藻糖、尿嘧啶、假尿苷、2，4-二氨基丁酸、葡萄糖、油酸。这12个代谢物可以作为NAFLD肝胆湿热证诊断的尿液中潜在的生物标志物；色氨酸代谢、赖氨酸生物合成、糖酵解或糖异生3条代谢通路与NAFLD肝胆湿热证密切相关。NAFLD肝胆湿热证的生物学本质体现在色氨酸代谢、赖氨酸生物合成、糖酵解或糖异生等方面。李肖飞等[8]运用代谢组学方法研究绝经后骨质疏松症常见实性证素与对照组之间的差异代谢物，并筛选绝经后骨质疏松症的潜在生物标志物。运用核磁共振氢谱（H-NMR）技术分析其血清的差异代谢物，涉及19种差异代谢物，发现绝经后骨质疏松症各组可区分并且存在较为明显的潜在生物标志物——甲酸，为临床治疗以及防治绝经后骨质疏松症提供了生物学依据。
第二节 中药效应精准评价
方剂有效性精准评价是挖掘和揭示中医药治疗优势的前提。代谢组学技术通过揭示药物作用于机体产生的复杂代谢产物组变化，揭示药物作用途径及相关靶点信息，阐明中药药效机制。孙丽丽等[9]运用UPLC/Q-TOF-MS技术探究当归补血汤（DBT）治疗2型糖尿病（T2DM）的作用机制，结合主成分分析和正交偏*小二乘判别分析等多元统计分析方法，筛选差异代谢物并进行鉴别。在血清中筛选出16种潜在的生物标志物，筛选出7条主要的代谢途径，分别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘油磷脂代谢，原发性胆汁酸生物合成，牛磺酸和亚牛磺酸代谢，苯丙氨酸代谢，脂肪酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成。T2DM小鼠血清中甘氨胆酸、牛磺胆酸和棕榈酸等11种代谢物下调，亮氨酸、白三烯E4等5种代谢物上调，各给药组均能使这16种潜在的生物标志物有良好的回调趋势，表明DBT主要通过提高机体对胰岛素的敏感性、调节糖和脂质代谢紊乱以及缓解炎症来改善T2DM的进程。于栋华等[10]采用尿液代谢组学研究穿山龙提取物抗急性痛风性关节炎作用，寻找相关的潜在生物标志物及相关代谢通路。运用UPLC/Q-TOF-MS结合模式识别方法分析鉴别出12种共同的潜在生物标志物，分别为肌氨酸、二甲基甘氨酸、脱氧胞苷、尿酸、5-羟色胺（5-HT）、L-胱硫醚、4-吡哆酸、脱氧尿苷、褪黑激素、5-甲氧基色胺、富马酸和胞苷。穿山龙提取物对肌氨酸、尿酸、L-胱硫醚、4-吡哆酸、脱氧尿苷、5-甲氧基色胺、胞苷、二甲基甘氨酸、褪黑激素、富马酸这10个生物标志物均表现出了纠正异常表达的趋势；与急性痛风性关节炎相关性*强的代谢通路为半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、色氨酸代谢。穿山龙提取物可能是通过促进半胱氨酸和甲硫氨酸代谢中胱硫醚向半胱氨酸的转化水平，上调色氨酸代谢中褪黑激素水平，实现对痛风性关节炎的防治作用。
吴天敏等[11]观察中医化湿泻浊法治疗原发性高血压痰湿壅盛证患者的有效性，采用1H-NMR结合偏*小二乘判别分析研究中青年痰湿壅盛证的原发性高血压患者的血清代谢组学，揭示该证内涵。通过分析比较对照组与痰湿壅盛型原发性高血压患者的相关指标，发现痰湿壅盛型患者乳酸、丝氨酸、葡萄糖、甲硫氨酸（蛋氨酸）、丙氨酸含量减少，极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、丙酮含量增多。化湿泻浊法能有效降低痰湿壅盛型原发性高血压患者的血压并改善其临床症状。邓小颖等[12]研究中药黄芪对小鼠心脏、大脑及血液代谢稳态的影响，从代谢调控角度阐明黄芪“修心健脑”的作用机制。采用液相色谱-质谱（LC-MS）和GC-MS联用技术全面表征小鼠血清、心脏和脑组织代谢指纹图谱，结合多元统计分析与非参数检验筛选、鉴定差异代谢物，聚焦相关代谢通路。多元统计分析表明，与对照组相比，黄芪干预后小鼠机体的代谢轮廓变化显著，在血清、心脏、脑组织中分别鉴定出15、19和17种差异代谢物，其中差异代谢物棕榈酸和LysoPC（20∶3）为3种生物样本共有且变化趋势一致。代谢通路富集分析结果显示，氨基酸代谢、磷脂代谢、脂肪酸代谢和三羧酸循环等通路受到显著影响。研究结果显示，黄芪可能通过调节能量代谢、氨基酸代谢及脂质代谢稳态发挥心脑血管保护作用，从代谢调控角度初步阐明了黄芪“修心护脑”的作用机制。
王妮等[13]基于UPLC/Q-TOF-MS联用技术的非靶向代谢组学探究人参干预脾气虚体质患者作用机制，结果发现并鉴定了13种潜在差异性生物标志物，差异性生物标志物主要参与机体的抗氧化及免疫功能、甘油代谢、脂肪酸代谢、糖代谢以及胆汁酸代谢等方面。何娟等[14]利用GC-MS联用技术对中药复方圣愈汤抗缺氧作用及代谢反应途径进行研究，寻找并分析阐明产生抗缺氧作用的代谢通路。运用GC-MS联用技术分析血清中代谢物，进行多元统计分析获取差异性代谢物信息、构建通路，并对抗缺氧原因进行解释。结果显示，圣愈汤各剂量组抗缺氧死亡时间较模型组均有明显延长，确定17个差异代谢物与该模型有关。圣愈汤具有明显的抗缺氧作用，获得的关键代谢通路涉及丙酮酸代谢，甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，三羧酸循环，以及糖酵解或糖异生。李自辉等[15]采用代谢组学方法分析玄参对脾虚水湿不化大鼠脾脏代谢产物的影响，探讨其相关作用机制。应用UPLC/Q-TOF-MS联用技术寻找潜在的关键性生物标志物，并分析其相关代谢通路。结果发现玄参可改善脾虚水湿不化大鼠的脾脏代谢产物，共鉴定出与脾虚水湿不化模型及玄参干预后具有共同差异的生物标志物15个，涉及19条相关的代谢通路，影响*为广泛的代谢通路可能是甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、鞘脂代谢、嘧啶代谢及花生四烯酸代谢。表明玄参对脾虚水湿不化模型大鼠的脾脏代谢产物具有调节作用，该机制可能与玄参具有的利湿功效有关。
唐孟秋等[16]基于1H-NMR探讨人参煎对2型糖尿病模型大鼠血清和尿液代谢组学的影响。模型组大鼠血清中的甲硫氨酸、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量极显著升高，3-羟基丁酸、乳酸、不饱和脂肪酸含量极显著降低；模型组大鼠尿液中的氧化三甲胺、甘氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、牛磺酸、磷酸胆碱的含量显著升高，肌酸、乳酸、乙酸、柠檬酸的含量显著下降。与模型组比较，给药组大鼠血清中的3-羟基丁酸、不饱和脂肪酸含量显著上升，牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量极显
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