《实用有菌环境条件植物组培快繁技术》:
第一节 有菌环境条件下的植物组培
快繁技术的由来
有菌环境条件下的植物组培快繁技术是作者应用常规植物组织培养技术进行快繁时,因遭遇较大的微生物污染,在采取防止污染措施取得满意效果的基础上,大胆设想、精心探索而形成的一种创新的植物组培快繁技术方法。
在常规植物组培快繁培养基中,加入杀菌剂经高压灭菌,在超净工作台内接种瓶苗污染率急剧下降,由20%~30%下降到1%左右。那么设想培养瓶经高压灭菌处理而培养基不进行高压灭菌是否可行呢?经实践检验是可行的。
接下来进一步研究:如果不用高压锅、不用超净台是否可以进行组培快繁呢?
首先,要解决的问题是培养瓶灭菌。因为普通培养瓶有被污染的、也有没有被污染的,经自来水清洗后,应该都是有菌的。如果这些洗过的培养瓶不进行高压灭菌,是否可以用别的方法处理达到灭菌效果?经无数次的药剂筛选试验和剂量梯度试验,终于在2005年培养瓶经药剂加水浸泡0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h试验,结果污染瓶清洗后浸泡在这种浓度下1.Sh以上装培养基培养没有污染发生,这就是液体S105杀菌剂的诞生。由于液体S105杀菌剂存在运输、操作安全性的问题,作者又把S105杀菌的剂型进行液改固试验研究,于是成功地开发了固体S105杀菌剂,解决了运输、操作的安全性问题。
其次,是解决不用超净台进行组培接种问题。常规组培接种工具用灼烧或灭菌器进行灭菌,是否可以用75%酒精浸泡达到灭菌效果呢?培养基不进行高压灭菌,用防污染杀菌剂用多少量才能在开放性的环境中接种?经过一年多试验,接种工具在70%~75%酒精中浸泡灭菌,培养基添加S106杀菌剂0.3ml/L可以达到接种瓶苗95010以上不污染,且长势除接种后7天左右略差外,到一个培养周期结束看不到明显差异。
最后,初代培养外植体是否可以在有菌环境条件下操作建立起无性系呢?
没有无菌水,没有无菌包,外植体是否可以用常规组培外植体的消毒方法,再加一定浓度S106杀菌剂浸泡外植体消毒而达到建立无性系呢?外植体按常规70%-75%酒精处理8-30s.自来水冲洗一次,倒去自来水,加0.1%升汞液处理8-12min,自来水涮洗5次,每次3min。而自来水是有菌的,按100ml自来水加S106母液0.SmL浸泡1-2h处理,再夹取外植体甩去大水滴,剪去接触药剂的两端,接种到杀菌培养基上培养,经无数次试验终于在2006年取得圆满成功。至此一种新的简易植物组培方法——有菌环境条件下植物组培快繁方法技术体系诞生了。
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