本书以介绍生物催化的基本概念、理论基础、工艺过程及其在医药、食品和化学工业等中的应用实例和研究进展为核心内容。由四部分知识体系构成：第一部分是生物催化的学科基础，包括生物催化的微生物学、酶学和手性化学基础；第二部分是改善生物催化反应的方法，包括生物催化剂的分子改造、固定化和非水相生物催化；第三部分是以反应技术的开发、反应过程的优化和反应器设计为主的生物催化反应器；第四部分是生物催化的应用，主要以应用实例方式对重要的水解酶、氧化还原酶、转移酶、醛缩酶等催化反应的原理、特点及其应用进行专论介绍。 本书适合从事生物化工、食品、医药等领域相关科技人员参考使用，也可供生物化工、生物制药、生物工程和生物技术专业高年级本科生或研究生使用。

第1章 绪论
　　1.1 生物催化概况
　　生物催化（biocatalysis）是生物学、化学、过程工程科学的交叉领域，其核心是利用酶或生物有机体（组织、整细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化生产食品、化学品、医药、能源、材料等，也被称为生物转化（bioconversion）。生物催化是与生命和人类活动关系*为密切的自然规律之一，人们一直致力于从应用目的出发研究酶和细胞催化作用，在特定的生物反应装置中利用其催化性质，将相应原料转化成有用的物质。生物催化技术首先从和它联系*紧密的食品、医药、农业开始，逐渐涉及化工、材料等行业，并通过这些行业影响社会生产、生活的各个方面。
　　作为一门交叉学科，生物催化通常会被不同学科的专业人员从不同的角度审视。化学家们关注的是生物催化中分子水平的化合物转化，化学工程师们更关注的是反应的过程性，而生物学家们则是从生物大分子、生物有机体甚至遗传进化角度去了解和掌控生物催化。生物催化在各个领域的成功应用需要三个学科的共同努力。近年来，基因组学、蛋白质组学等生物技术的进步为生物催化的基础研究和应用研究提供了源源不断的动力支撑。继以1982年重组人胰岛素上市为代表性的医药生物技术（红色生物技术）、以转基因植物为代表的农业生物技术（绿色生物技术）后，人们普遍认为以生物催化与生物转化为核心的工业生物技术（白色生物技术）将成为生物技术革命的第三次浪潮。根据绿色化学的十二条准则，生物催化是当前国际公认的*绿色的化学转化技术之一。世界经济合作与发展组织（OECD）指出：“生物催化技术是工业可持续发展*有希望的技术”。生物催化转化的成功应用，将形成以生物能源、生物材料、生物化工、生物冶金等为代表的现代工业体系，在全球范围内掀起一场新的现代工业技术革命。有效地提升化学、制药、发酵、食品等传统产业。
　　1.2 生物催化技术的特点
　　生物催化是基于酶催化的生物反应过程，对温度与压力有着特殊的要求，通常需要在常温、常压等温和反应条件下进行。而酶对底物有着高度的特异性，因此，生物催化表现出催化效率高，副产物少的优点。由于生物催化的高效性和高选择性，它们可以完成传统化学过程所不能胜任的专一性反应，易于得到相对较纯的产品，减少废物排放，降低工业生产的环境污染程度，在食品、化学、医药等工业上具有越来越大的吸引力。另外，相比于高温、高压下进行的化学反应过程，常温、常压下的生物催化反应过程还具有能耗少，反应过程稳定，可控性强等特点。生物催化技术既是一种可持续发展技术，也是一种环境友好技术，它与食品、医药、化工等的结合都极大地推动了这些领域的发展。
　　生物催化的工业化应用速度虽然近年来呈现加快发展趋势，但目前的贡献率还不高，很多工艺还没有达到可与传统工业技术相抗衡的程度。究其原因，主要是生物催化还存在着一些缺陷，如酶常常存在的底物或产物抑制现象易造成反应转化率和生产能力低，酶对温度、pH等稳定性差而易失活，许多氧化还原酶、转氨酶等需要辅因子存在才能表现催化活性和酶通常仅在水溶液中实施高效的催化行为等。但随着生物技术的发展，这些生物催化的不足都已经或即将找到解决方法。利用现代分子生物技术来改造天然催化剂，制备高效稳定、选择性强，并且适合工业应用的超级人工生物催化剂将成为可能。
　　1.3 生物催化的发展史
　　纵览人类发展的历史，早在远古时代人们就已经开始利用生物催化技术来生产食品和进行酿造。生物催化在食品加工中的应用可以追溯到公元前6000年，如*早的苏美尔人和巴经伦人利用发酵技术酿酒，埃及人利用酵母生产面包，以及利用凝乳酶生产奶酪等，都是生物催化在食品领域的一些早期应用。“酶”（enzyme）这个词就是由德国科学家威廉 库恩（Wilhelm Kuhne）在1878年提出的，它的字面意思是“在酵母中”（in yeast）。人类使用的第一个酶，是19世纪70年代用盐水从未断奶小牛的胃中提取出来的凝乳酶，被用于催化乳中酪蛋白胶束结构破坏使牛奶凝结制作奶酪。然而，现代生物催化研究一般认为始于巴斯德时代（1822～1895），法国科学家路易斯 巴斯德（Louis Pasteur）在1856～1860年首次发现了微生物的发酵特性。至19世纪70年代末，人们发现甚至经过破碎的酵母细胞提取物也可以使蔗糖发酵。导致蔗糖发酵的酶被称为酿酶或酒化酶（zymase）。利用生物催化转化发酵生产乙醇、有机酸等化学品的历史并不很久，到19世纪后期才有文献报道。乳酸大概是有文献记载的第一个运用生物催化转化技术工业生产的光学纯化学制品，它于1880年在美国面市。20世纪30年代果胶酶已开始被用于果汁的澄清。当时固定化的蔗糖酶（又称转化酶，invertase）也开始替代稀酸被用于合成转化糖（蔗糖水解产生的果糖、葡萄糖混合物）。
　　生物催化在化学领域的应用从20世纪初持续增长。人们通过对天然微生物的筛选和诱变，已经可以生产氨基酸、有机酸和维生素等简单的代谢物。其后，这个领域的发展就几乎进入停滞期，直到50年代中期，一些生物催化法制备甾体方案的提出才扭转了这一局面。然而，生物催化真正意义上的商业化和大规模的工业应用出现在20世纪60年代以后，当时传统的酸催化淀粉水解工艺被一系列酶催化的淀粉水解工艺取代。1959年一家名为“Novozymes”的丹麦公司首次将芽孢杆菌蛋白酶商业化。20世纪70～80年代，生物催化已经取得前所未有的进步，每年都有超过500篇相关文章发表，有机化学家对生物催化进行不对称合成的兴趣也日益增长，生物催化开始进入到若干大宗化学品和精细化学品的生产，一些传统的化学反应工艺逐步被生物催化反应所替代。但应用仍比较狭窄，制造规模和成本仍无法与化学制造的产品竞争。
　　进入21世纪后，强烈的社会需求和技术上的可能性使得生物催化重新崛起，并得到了飞速发展。面对化石资源不断枯竭、环境污染日益加剧的严重局面，由传统化学工业转向以生物可再生资源为原料，生物质可再生能源为能源，环境友好、过程高效的以生物催化与生物转化为核心的生物加工业已成为人类社会可持续发展的迫切需求。今天的微生物学、生物技术和工程学的快速发展，大大地推动了生物加工业的基础研究和应用研究，为生物催化的崛起提供了不竭的动力。继20世纪80年代与90年代生物技术分别为生物医药与农业带来了革命性的飞跃之后，以生物催化为核心的生物加工业已经成为生物技术革命的第三个浪潮。
　　在食品领域，生物催化技术大大提高了生物质原料的利用效率，有效改善了食品品质和营养结构，为食品工业的飞速发展奠定了良好的基础。食品生物催化制造已经成为未来社会可持续发展的重要途径。
　　1.4 全球生物催化酶制剂市场规模
　　近年来，酶生物催化剂的全球市场已经建立，市场规模逐年增加，根据数据，2016年全球酶制剂市场规模约为38亿美元，2017年约为54亿美元，2018年约为56亿美元，2020年接近60亿美元，预计2024年全球工业酶制剂市场规模将增长至77亿美元。食品加工业一直是酶的主要消费领域，2017年食品和饮料行业市场份额*高，总额达14亿美元，占市场总额的26%，其中烘焙、酿造、乳品、营养、香料、脂肪和油脂改性等是一些主要的消费领域。根据规则，食品用酶可分为食品添加剂和食品加工用酶两大类。大多数食品酶属于食品加工用酶的范畴，而其中只有很少属于食品添加剂的范畴。生物燃料是继食品加工业之后的第二大酶消费领域，总额达9.69亿美元，占市场总额的18%。洗涤剂行业占第三位，总额达7.54亿美元，占市场总额的14%。预计未来5年生物燃料领域市场增长*快，复合年增长率为7.3%。在发展中国家，随着人们生活方式的改变和可支配收入的增加，对即食食品、有机食品的需求日益增加，以及对食品安全和标准的高度重视，导致了对酶的需求增加。全球各国政府鼓励使用生物燃料作为化石能源的清洁替代品，也刺激了工业酶市场的发展。生物技术领域的进步，特别是蛋白质工程的进步，进一步推动了工业酶需求量的增长。
　　当前，诺维信（Novozymes）是全球*大的酶制剂公司，其公司产品占有我国50%的工业酶制剂市场。丹尼斯克（Danisco）、罗氏（Roche）、健赞（Genzyme）、艾尔建（Allergan）和巴斯夫（BASF）都是该行业的巨头。直到*近，酶的生产都主要集中在丹麦、德国、荷兰和美国等一些发达国家。诺维信和丹尼斯克是丹麦*大的两家公司，它们共同占据了整个酶制剂市场的70%以上。
　　我国酶制剂起步较晚，目前正处于快速发展阶段，产品竞争力逐步提升。国内许多酶制剂生产企业已经形成相应的自主品牌，部分国内品牌的产品在国际市场上不断获得认可，已成为亚洲的主要酶生产国。目前饲用酶制剂不但完全可替代进口，占领了大部分国内饲用酶制剂市场份额，而且成为少数几个出口创汇的饲料添加剂品种之一。但与世界领先的诺维信、杜邦（DuPont）等公司在规模表达系统开发及保护、蛋白质工程改造、发酵工艺等方面仍有差距。食品酶、工业洗涤酶等高端领域目前以国外品牌为主，仍有很大的进口替代市场。目前，许多国际公司都投资我国的酶制剂行业。如诺维信酶制剂公司在天津有生产基地，并在全国都有分厂和合作工厂。未来随着我国酶制剂的基础技术研发水平和发酵工艺不断提高，生产成本持续降低，产品品质的提升，特别是跨国企业拥有的新菌种、新基因等核心技术壁垒的打破，都将进一步增强我国酶制剂企业的国际竞争力。未来，由于食品加工、生物燃料、环保产业、动物饲料、生物化工、制药领域等下游产业对酶的需求快速增长，酶制剂市场需求将继续增长，酶制剂产业正面临快速发展的时机。
　　1.5 生物催化与可持续性
　　当前，化石资源枯竭、环境污染、温室效应和公众健康问题逐渐升级成为人类日益提高的物质需求的主要矛盾。作为工业生物技术的核心，基于酶的生物催化技术被誉为工业可持续发展*有希望的技术，它将有望使人类摆脱目前过分依赖石油和煤炭等不可再生的化石资源的“碳氢化合物经济”，逐渐过渡到利用储藏在地球表面的大量可再生生物质，制取人类所需的能源与资源。
　　以化学催化剂为基础的反应往往需要在高温和高压条件下进行，这导致了高能耗和下游过程浪费大量的冷却水。酸和碱催化工艺在高温高压下运行，因此需要专门设计的设备和控制系统，这大大增加了工艺的成本。这些缺点都可以用基于酶的生物催化来消除。与化学催化剂一样，酶可以加快反应，但不影响反应的热力学。相比化学催化剂，酶有一些重要的优点。生物催化是高效、高选择性的温和催化体系。即使在生物体外，酶也能催化多种天然的和人工合成的化学分子发生诸多转化反应，并显示出优良的选择性，包括立体选择性、位置（区域）选择性和官能团选择性。许多酶可以接受非天然底物并将其转化为目标产物。酶的高选择性在催化合成中具有以下几个优点，如副产物少，下游分离纯化处理容易和更高的环境友好可持续性等。温和的操作条件，如低温和低压，也是酶生物催化的优点，使得反应可以使用简单的设备。酶的高效性使得即使在工业规模上酶的使用量也会很少。酶的生物催化反应很容易通过剂量、时间和温度进行控制，操作简便。如今，许多商用酶在不同溶剂体系下都表现出极好的稳定性，半衰期可达数月甚至数年。蛋白质工程的方法更使酶适应特定的工艺条件成为可能。
　　目前，以微生物与酶技术应用为基础的生物催化已经开始进入了包括食品、发酵、农产品加工、有机物合成、药物和高分子材料在内的很多领域，用生物催化技术来生产食品、药品、精细大宗化工产品等，已有相当大的发展。生物催化技术已成为精细大宗化学品和高附加值医药中间体的生产实现低耗、节能、环保、可循环、健康可持续发展的有力保证。
　　食品由大量的小分子和大分子结构组成，它们影响了食品的流变、形状、色彩等性能，同时对于人类的消化、吸收以及健康都具有重要的影响。通过生物催化反应实现食品结构的转化，对于改善产品的口感和品质具有重要的作用。为实现食品工业可持续发展，食品的生产和处理方式也必须改变，包括采取全新做法来减少浪费

目录
前言
第1章　绪论　1
1.1　生物催化概况　1
1.2　生物催化技术的特点　1
1.3　生物催化的发展史　2
1.4　全球生物催化酶制剂市场规模　3
1.5　生物催化与可持续性　4
1.6　食品工业中的生物催化及其工艺强化　5
1.6.1　乳制品工业　6
1.6.2　烘焙工业　7
1.6.3　果蔬加工业　8
1.6.4　酿酒工业　9
1.6.5　油脂加工　10
1.6.6　肉制品工业　10
1.6.7　香精香料业　11
1.7　食品生物催化制造　12
1.8　生物催化的安全性评价　13
第2章　生物催化的微生物学基础　15
2.1　用于生物催化的主要微生物　15
2.1.1　细菌　15
2.1.2　放线菌　16
2.1.3　霉菌　17
2.1.4　酵母菌　17
2.2　微生物酶的筛选和菌种选育　18
2.2.1　微生物菌种的分离　18
2.2.2　诱变育种　20
2.3　微生物酶的发酵生产　22
2.3.1　氧化还原酶　22
2.3.2　水解酶　24
2.3.3　裂合酶　32
2.4　微生物生物合成：重要天然产物的来源　33
2.4.1　氨基酸　34
2.4.2　嘌呤和嘧啶及其核苷酸　37
2.4.3　维生素　39
2.4.4　有机酸　40
2.4.5　乙醇及相关化合物　42
2.4.6　次生代谢物　43
参考文献　45
第3章　生物催化的酶学基础　48
3.1　酶的分类组成与结构特性　48
3.1.1　酶的分子结构与化学组成　48
3.1.2　酶的分类　50
3.1.3　酶的空间结构及活性中心　51
3.2　酶的分离纯化　52
3.2.1　酶的来源　52
3.2.2　酶的分离　53
3.2.3　酶的纯化　55
3.3　酶的作用机制　58
3.4　酶的催化动力学　60
3.4.1　酶促反应初速度　60
3.4.2　米氏方程　60
3.4.3　影响酶促反应速率的因素　63
3.4.4　激活剂和抑制剂对酶促反应速率的影响　64
3.5　酶活性调节　65
3.5.1　酶原激活调节　66
3.5.2　酶活性的别构调节　66
3.5.3　酶分子的共价修饰　68
3.6　酶在食品领域的应用　68
参考文献　71
第4章　生物催化的手性化学基础　72
4.1　光学活性与手性　72
4.1.1　自然光和偏振光　72
4.1.2　旋光性与比旋光度　72
4.1.3　手性分子与旋光性　74
4.1.4　对映异构体与非对映异构体　74
4.2　构型与构象　78
4.2.1　分子构型　78
4.2.2　分子构象　80
4.3　生物催化反应的选择性　80
4.3.1　化学选择性　80
4.3.2　区域选择性　82
4.3.3　立体选择性　82
4.4　手性化合物外消旋体的生物催化去对称化　83
4.4.1　脂肪酶催化的手性化合物去对称化　84
4.4.2　氧化还原酶催化的手性化合物去对称化　86
4.4.3　酰胺酶催化的手性化合物去对称化　87
参考文献　87
第5章　生物催化剂的分子改造　89
5.1　化学修饰技术　89
5.1.1　小分子修饰　89
5.1.2　定点突变与化学修饰结合　90
5.1.3　辅因子引入　90
5.1.4　交联技术　90
5.1.5　单功能聚合物　91
5.2　定点突变技术　91
5.2.1　寡核苷酸引物介导的定点突变　92
5.2.2　PCR介导的定点突变法及其改进——大引物突变法　92
5.2.3　盒式突变　93
5.3　DNA改组技术　94
5.4　酶的化学糖基化　96
5.4.1　用于酶化学糖基化修饰的分子种类　96
5.4.2　常用的化学糖基化修饰　96
5.5　酶的定向进化　99
5.5.1　酶的分子定向进化的概念——物种进化与酶定向进化　100
5.5.2　酶定向进化技术的发展历程　100
5.5.3　酶定向进化的主要方法　101
5.6　结合定点突变的酶理性设计改善酶特性的具体应用　103
5.6.1　重塑活性中心提高酶的底物特异性　103
5.6.2　重塑活性中心改变酶促反应类型　104
5.7　基于DNA改组和酶定向进化非理性设计改善酶特性的具体应用　105
5.7.1　改善酶的底物特异性　105
5.7.2　提高酶的对映体选择性　105
5.7.3　改善酶反应活性　106
5.7.4　定向进化改善酶稳定性　106
5.7.5　改善酶的溶解性和异源表达　109
5.7.6　创造新的活性　109
5.7.7　增加微生物酶的抗性　109
5.8　酶定向进化的优势和前景　110
参考文献　110
第6章　生物催化剂的固定化　112
6.1　传统酶固定化技术　112
6.1.1　物理吸附法　112
6.1.2　物理包埋法　113
6.1.3　共价结合法　113
6.1.4　化学交联法　113
6.1.5　不同传统酶固定化技术的优缺点　114
6.1.6　传统固定化酶的载体材料　114
6.2　新型酶固定化技术　117
6.2.1　新型固定化载体材料　117
6.2.2　新型酶固定化方法　127
6.3　酶定向固定化技术　129
6.3.1　生物酶介导的定向固定化技术　129
6.3.2　化学修饰介导的酶定向固定化技术　130
6.3.3　界面聚合微囊固定化技术　130
6.3.4　基于表面展示技术的酶固定化　130
6.4　多酶共固定化　131
6.4.1　多酶的非特异性共价共固定化　131
6.4.2　多酶的非特异性非共价共固定化　132
6.4.3　多酶的非共价包埋共固定化　132
6.4.4　多酶位点特异性共固定化　133
6.5　其他新型固定化技术　134
6.5.1　辐射处理　134
6.5.2　等离子体处理　134
6.5.3　纳米技术处理　135
6.5.4　超声波处理　135
6.5.5　磁处理　135
参考文献　135
第7章　非水相生物催化　136
7.1　非水相中酶学基础及非水相机理　136
7.1.1　非水相中酶学基础　136
7.1.2　非水相机理　138
7.2　提高非水相中酶的耐受性　140
7.2.1　非水溶剂对酶催化的影响　142
7.2.2　体系含水量对酶催化的影响　143
7.2.3　pH和离子强度　144
7.2.4　温度　144
7.3　非水相生物催化及其特点　145
7.4　非水相生物催化的影响因素　147
7.4.1　反应温度的影响　147
7.4.2　非水相介质的影响　147
7.4.3　底物浓度和摩尔比的影响　148
7.4.4　催化剂的影响　148
7.4.5　有机溶剂对酶催化反应的影响　148
7.4.6　非水相体系中微量水对酶催化性能的影响　149
7.5　生物催化反应体系的分类　150
7.5.1　有机相体系　150
7.5.2　超临界流体体系　150
7.5.3　离子液体体系　151
7.5.4　反胶束体系　152
7.5.5　全细胞体系　153
7.6　物理场强化非水相生物催化　154
7.6.1　超声波强化非水相生物催化　154
7.6.2　微波强化非水相生物催化　155
7.6.3　磁场强化非水相生物催化　156
7.6.4　热等静压技术强化非水相生物催化　156
参考文献　157
第8章　生物催化反应器　158
8.1　生物催化反应器概述　158
8.2　酶反应器基本设计　159
8.2.1　设计基本原理　159
8.2.2　理想条件下酶反应器的基本设计　160
8.3　多相体系中扩散限制对生物催化反应器设计和性能的影响　171
8.4　热失活对酶反应器设计和性能的影响　173
8.5　脂肪酶催化连续反应器的构建及操作稳定性　175
8.5.1　反应器构建的流程　175
8.5.2　应用——膜反应器中脂肪酶动态拆分萘普生甲酯　177
8.6　酶反应器操作方式对拆分产物光学活性的影响　179
参考文献　181
第9章　蛋白酶　182
9.1　蛋白酶的种类　182
9.2　蛋白酶活性检测方法　183
9.2.1　均相检测蛋白酶活性　183
9.2.2　基于分离的活性检测试验　186
9.2.3　改进型蛋白酶活性的测定方法　187
9.3　重要蛋白酶的结构与功能　187
9.3.1　丝氨酸蛋白酶　187
9.3.2　天冬氨酸蛋白酶　189
9.3.3　碱性蛋白酶　191
9.3.4　风味蛋白酶　191
9.4　蛋白水解酶催化机制　192
9.4.1　蛋白酶催化底物的基本机制　192
9.4.2　蛋白酶水解底物的特异性作用机制　193
9.4.3　酶与底物的结合部位蛋白酶的位点专一性　194
9.4.4　酶分子表面电荷作用　194
9.5　蛋白酶催化蛋白质酶解法合成多肽　195
9.6　固载化酶催化合成多肽　196
9.6.1　溶剂对固定化酶催化合成多肽的影响　196
9.6.2　载体与固定化方法　196
9.6.3　pH及温度　197
9.7　酶催化拼接合成多肽　197
9.7.1　转肽酶　197
9.7.2　连接酶　198
9.7.3　氧化还原酶　198
9.8　蛋白酶在食品领域的应用进展　199
9.8.1　蛋白酶在食品中的作用机理　199
9.8.2　蛋白酶在食品工业中的应用研究　200
参考文献　202
第10章　青霉素酰化酶　206
10.1　β-内酰胺类抗生素简介　206
10.1.1　酶促一锅合成法　206
10.1.2　原位产物排出法　207
10.1.3　反应介质体系与酶促合成　207
10.1.4　水两相体系　207
10.1.5　水-有机溶剂混合体系　207
10.1.6　悬浊液-悬浊液体系　208
10.1.7　冰冻介质　208
10.1.8　酶固定化新方法与酶促合成　208
10.2　半合成β-内酰胺类抗生素化学法与酶催化法合成比较　208
10.3　生物催化合成的策略　209
10.3.1　生物催化　209
10.3.2　生物催化的应用　210
10.3.3　固定化酶　210
10.3.4　青霉素酰化酶概述　211
10.3.5　青霉素酰化酶的固定化　211
10.3.6　青霉素酰化酶催化合成抗生素　214
10.4　青霉素酰化酶生物催化剂　214
10.4.1　青霉素酰化酶的种类　215
10.4.2　青霉素G和青霉素V　216
10.4.3　催化反应条件　217
10.4.4　青霉素酰化酶的催化应用　217
10.5　均相和非均相水-