第一章　绪论
　　第一节　实验血液学技术的历史和意义
　　从《黄帝内经》中对血液的记载，到显微镜问世后血液有形成分的逐步观察鉴定，人类开始了系统和科学的血液学研究。随着科技的进步，基于动物体内实验和体外实验研究血液系统发生机制、功能、病理改变及临床应用的“实验血液学”已成为血液学研究的基础，而这种医学模式的转变离不开实验血液学技术的发展。
　　一、实验血液学技术发展简史
　　从研究输血治病救人时提出血型概念，到各种血液疾病的诊治，实验血液学技术的发展推动了血液学的深入研究。在细胞生物学、系统生物学的影响下，为满足实验血液学更高的研究需求，实验血液学技术也在推陈出新，逐步发展了分子生物学技术、流式细胞术、细胞影像学技术、实验动物技术、实验病理学技术、电子显微镜技术、生物信息学技术、人诱导多能干细胞技术等。
　　光学显微镜的问世，让人们观察到了血液中的红细胞（1673年）、白细胞（1749年）和血小板（1842年）。随着科学的发展，研究人员对显微镜的分辨率提出了更高的要求，从而磁电子透镜（1926年）、透射电子显微镜（1931年）、扫描电子显微镜（1938年）等应运而生。电子显微镜以其高分辨率的优势使血液学研究进入更精细的探索阶段。同时，因为活细胞可以更真实地还原生理状态和呈现线性动态过程，越来越多的科学家并不满足于固定样本的静态研究，纷纷开始转向活细胞成像的动态研究。不仅如此，随着细胞影像技术的发展，以往在传统显微镜下难以辨识的结构，或是一个变化的动态过程，抑或是某些非常微弱的信号等，都可以通过高内涵活细胞工作站等细胞影像技术进行识别。
　　然而，对研究人员而言，目前应用各种影像技术得到一组图片并不困难，而困难在于如何分析成像后的图像数据。为此，研究人员开发了许多生物图像处理软件，如ImageJ、Imaris、Volocity、Image-Pro Premier、Huygens、AutoQuant等，应用这些软件可以完成反卷积处理及细胞计数、细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质定量、蛋白质共定位、示踪等图像数据的处理和分析。
　　自血液有形成分被发现以来，血液学的发展开始进入细胞水平的研究。从对细胞计数（1930年）及利用细胞检测自动化仪器进行细胞数统计（1934年）的研究，到引入显微光度术（1936年）并利用结合荧光素的抗体标记细胞内的特定蛋白（1940年），再到1959年B型Coulter粒度仪问世及1969年第一台荧光检测细胞计的研发，科学家从未停止过探索的脚步。尤其是进入21世纪，随着光电技术的进一步发展，光学系统、检测器单元和电子系统可按照实验要求更换模块，使流式细胞分析和分选仪器在实验血液学中成为无可替代的研究工具。同时，流式细胞仪由最初的手动调节逐渐走向全自动化调节，包括光路和液路；激光器的数量由1个逐渐增加到5个；荧光通道也逐渐增加，目前多达30个。
　　除了形态学的观察外，分子水平的检测是血液成分鉴定中非常重要的一部分，实验血液学技术完成了从微流体蛋白免疫分析、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）到高通量测序等发展阶段。血液学研究的对象也在逐步转变，从经验医学的人体试验，到实验动物模型的构建，再到人诱导多能干细胞体外模型的应用，实验血液学技术实现了最大限度模拟人体生理病理环境，为科学研究提供了一种不伤害人体、不违背伦理的研究方法。
　　二、实验血液学技术概论
　　17世纪中叶，罗伯特 胡克和列文 虎克研发的高倍显微镜让人类的观察从宏观世界走进微观世界。光学显微镜利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，血液中的红细胞、白细胞和血小板等有形成分依次被发现，同时血液无形成分（血浆）也成为生物化学和免疫学的重点研究对象。1901年“血型之父”卡尔 兰德施泰纳正是将血样中的血细胞和血清进行分离，并通过实验首次发现人类红细胞血型，从而为ABO血型系统的建立奠定了基础，避免了不同血型输血引起的致死性输血反应，从而保证了输血安全。此外，血液中血浆、红细胞、血小板等成分的分离方法和技术发展，使输血治疗进入了成分输血的新时代。
　　但是，光学显微镜分辨率低，放大倍数一般为40～1000倍（包括油镜），只能看到细胞中的细胞核等大概结构，无法观察到亚显微结构。而电子显微镜的问世解决了这一技术难题。通过透射电子显微镜，可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2μm的细微结构，能实现超薄样本（细胞或者生物组织）的切片制备。同时，电子显微镜也可以实现从免疫细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。
　　为了更快捷高效地处理图像数据，研究人员开发了各种生物图像处理软件，依照不同研究目的对图像数据进行分析。目前常用的图像处理软件有以下几种：ImageJ是一款Java图像处理和分析程序，可实现对8bit、16bit、32bit图像的展示、分析、处理、传输等基础操作；Imaris是一款对2D～5D图像进行渲染及交互分析的软件，拥有表面结构渲染、视频录制、点计数和轨迹追踪、神经分析、细胞分析板块、共定位分析等功能；Volocity是一组高度集成化的软件，具有多通道荧光标记细胞图像的立体观测、数据采集、定量分析及高品质图像或者动画电影制作等功能；采用高级反卷积算法的Huygens软件，针对不同类型光学显微镜系统如宽场成像、点扫描共聚焦、转盘共聚焦、多光子、受激发射损耗超分辨率成像、光片照明进行去卷积处理，最终获得高分辨率和准确的图片分析结果。
　　流式细胞术（flow cytometry，FCM）是集流体学、力学、电学、光学为一体的实验技术，利用流式细胞仪对细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选，可以分析一群细胞中各种细胞的比例，还可以通过分离含有单细胞的液滴从一群细胞中分选出目标细胞。流式细胞术在血液学研究中有广泛的用途，不仅在白血病及淋巴瘤的免疫分型中起重要作用，而且应用于血小板计数、血小板自身抗体测定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析，以及红细胞表面相关免疫球蛋白测定、红细胞血型抗原分析等方面。
　　20世纪初，造血调控及造血干细胞研究成为血液学研究的热点领域。造血干细胞具有自我更新能力及多向分化潜能，最终可生成各种血细胞成分。因此，造血干细胞的分选和移植是重建正常造血和免疫功能的一种重要治疗手段。流式细胞分选仪便可以实现分选需求。安装在流动室中的超高频压电晶体的喷嘴，可以产生高频振荡，使含有待测细胞的液流断裂为均匀的液滴，带电的液滴通过电场时发生偏转，进入相应的收集管中，从而实现对造血干细胞的分选。
　　FCM还广泛应用于基础血液学，如红细胞和白细胞的计数、分类及其功能研究，造血干细胞、红细胞、粒细胞、巨核细胞、正常骨髓细胞等DNA含量与细胞表型研究。同时在血液病学方面，FCM可用于白血病的分类和细胞动力学研究，预测化疗效果、微小残留病变及一部分恶性血液病，如骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。此外，在器官和骨髓移植前，FCM可以进行交叉配型和骨髓中肿瘤细胞或造血干细胞的监测，移植后FCM可用于监测血液或移植物内免疫成分的变化，以预测移植后免疫排斥反应、细胞免疫抑制治疗效果和移植物存活情况等。
　　按照研究的需求，未来FCM将从单纯应用大型仪器转变为使用便携式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪，以适应多种研究环境。同时为满足多种检测标志物的共定位分析和细胞捕捉，荧光参数检测也将从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测超过40种荧光信号。此外，检测参数从相对定量发展为绝对定量，对细胞或微粒上标记的荧光分子进行定量分析，从而对细胞的生物分子进行精确测量。例如，在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的研究和治疗中，FCM可对外周血中的CD4+ T细胞进行绝对计数，进而反映病情进展及监测疗效。
　　实验血液学技术的进展也推动了血液学研究由细胞水平向分子水平的延伸与探索。以蛋白质印迹为代表的微流体蛋白免疫分析技术打开了血液学分子研究的大门。免疫印迹实验以特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样本进行着色，通过分析着色的位置和深度，获得特定蛋白质分子在细胞或组织中表达的信息，此技术广泛应用于基因在蛋白质水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
　　20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因体外分离技术，研发了聚合酶链式反应（PCR），其可在体外特异性地扩增某个基因，从而实现对核酸的体外研究和应用。随着生物实验需求的不断发展，PCR技术已经逐渐演化出一系列侧重于不同实验目的及应用的分类，其中较为常见的包括降落PCR（touchdown PCR）、多重PCR（multiplex PCR）、定量PCR（qPCR）和微滴数字PCR（ddPCR）。从此，血液学的研究便进入了基因时代。目前在临床检测和基础研究中常用的是实时荧光定量PCR技术，包括绝对定量PCR和相对定量PCR，主要用于检测mRNA。该技术的特点是可以减少PCR之后的操作，在比较不同浓度的mRNA方面具有比较宽的动力学范围。目前此技术主要用于核酸定量分析、基因表达差异分析、单核苷酸多态性（SNP）检测、甲基化检测、产前诊断、病原体检测、肿瘤基因检测、药物疗效评价等。此外，荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）也顺应研究的需求而产生，应用于染色体核型分析及基因扩增、基因重排检测等。该技术源于以核素标记的原位杂交技术，可检测定位在经分离的染色体乃至完整细胞中特定的正常或异常DNA序列。
　　随着研究深入发现，仅仅通过PCR、FISH等技术远远无法满足获得大量核酸序列信息的需求。1977年以Sanger测序法为代表的第一代测序技术使血液学的研究走进大数据时代，其主要特点是测序读长可达1000bp，准确率高达99.999%。但测序成本高、通量低等缺点，严重影响了其大规模应用。经过技术开发和改进，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为代表的第二代测序技术问世，其很大程度上降低了测序成本，大幅提高了测序速度并具有高准确性，将完成一个人类基因组测序的时间从3年缩短为1周。而以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序为代表的第三代测序技术则实现了单分子测序和超长读长，其测序过程甚至无须进行PCR扩增。此外，基于半导体芯片的Ion Torrent非常适合小基因组和外显子验证的测序，发展成为新一代测序技术。短短的几十年时间，高通量测序技术实现了从第一代到第三代乃至第四代的大跨步前进，测序读长更是完成了从长到短再到长的过程。测序技术的每一次革新，都推动了基因组研究、疾病诊疗、药物研发等领域的巨大发展。
　　以往测序技术处理的对象是成千上万个细胞，但正如德国哲学家莱布尼茨所说，“世界上没有完全相同的两片树叶”，所以这种测序得到的变异水平也是成千上万个细胞的平均水平。而如果对单个细胞进行测序分析，则可以揭示每个细胞的个体变化，使不同细胞类型得以精细区分。同时，单细胞多组学技术系统、全面地揭示了细胞网络和分子网络复杂的相互作用机制，提供了更多的数据。为此，单细胞测序技术在2013年被Nature Methods杂志评选为年度技术，单细胞多组学技术在2019年被Nature Methods杂志评选为年度技术。
　　与此同时，如何对高通量测序所带来的大数据进行处理是摆在科研人员面前的一道难题。无论是DNA测序、RNA测序，还是单细胞测序，都需要筛选有效数据，进行数据质控及针对特定需求进行结果分析。针对基因组测序数据常用的分析方法有基因组测序数据比对、单核苷酸多态性检测和小片段插入缺失分析、癌症基因组体突变分析、拷贝数变异（CNV）分析、结构变异分析等。