《现代生物农业畜牧兽医：动物源抗菌肽》：
第一章 抗菌肽概述
抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），又称抗微生物肽或宿主防御肽（host defensive peptide，HDP），是自然界生物体内广泛存在的小分子多肽，具有抵抗外源病原体感染的活性，是宿主天然免疫系统的重要组成部分。抗菌肽广泛分布于动物、植物和人的体内，同时因其高活性、低毒性、抗菌谱广和低耐药性等特点而成为抗生素替代品的后起之秀。
起初分离的抗菌活性多肽对细菌具有广谱、高效的抗菌活性，被人们称为“antibacterial peptide，ABP”，中文译为抗细菌肽，简称抗菌肽。但是，随着研究的深入，人们发现抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗癌细胞、免疫调节等功能，故将这类活性多肽称为“peptide antibiotics”，中文译为多肽抗生素或肽抗生素。“肽抗生素”较好地概括了这类活性多肽的功能特征，被多数学者所推崇。在国内，各种期刊文章中关于这类活性多肽均称为抗菌肽。同时，在国外的期刊和书籍等文献中，抗菌肽的英文为“antimicrobial peptide，AMP”。因此，为了与国际接轨，本书将抗菌肽的英文译为“antimicrobial peptide，AMP”。
第一节 抗菌肽的研究简史
一、寻找抗生素替代品的必然性
自20世纪40年代第一个抗生素——青霉素被发现后，人类迎来了治疗传染病的曙光。随着研究的深入和临床的需要，人类又相继开发了多种抗菌药物。这些抗菌药物在治疗人类和动物疾病方面作出了不可磨灭的历史贡献。
但是，由于抗生素的广泛使用，临床上不断出现耐药菌甚至多重耐药菌，使得细菌性疾病的预防和治疗成为一大难题。这已引起了科学家的广泛关注。目前，这个问题越来越严重，已经成为治疗感染性疾病的最大障碍。据报道，耐药菌引起的医院感染人数已达到住院感染患者总人数的30%左右。近年来，细菌的耐药性和耐药谱仍在以惊人的速度增长和扩展。特别是具有多药物抗性（multidrug resistance，MDR）的超级细菌在世界范围内的相继出现，严重威胁着人类和动物的生命安全与健康。因此，人类迫切需要开发新抗生素来解决细菌的耐药性问题。人类开始对传统抗生素进行改造以降低耐药性，并不断开发新型抗生素。然而，新抗生素的研发速度远远跟不上耐药菌的出现速度，而且新抗生素的开发不仅花费高，还需要经过漫长临床试验的验证。另外，从2006年1月开始，欧盟全面禁止食品动物使用抗生素类促生长饲料添加剂。在这种形势下，寻找具有安全、有效及不易产生耐药性的抗生素替代物成为必然选择。
在寻找抗生素替代物的过程中，人们逐渐把目光投向抗菌肽，认为抗菌肽有望成为传统抗生素的替代物。因为，抗菌肽的作用机制完全不同于传统抗生素，其能杀死耐药菌及其突变株，而且在使用过程中不易形成具有耐药性的突变株。再者，抗菌肽在使用过程中无不良作用。因此，对抗菌肽的研究成为必然趋势。20世纪90年代以来，对抗菌肽的研究、开发和利用一直是国际生物医学界关注的热点之一。
二、抗菌肽研究简况
1922年，Flaming（弗莱明）在急性鼻炎患者的鼻腔分泌物中分离出一种具有杀菌功能的溶菌酶，是首次在人体内分离的可溶性抗菌物质（朱钧萍等，2013）。1939年，Dubos从芽胞杆菌的培养上清中发现了短杆菌肽（gramicidin），对革兰阳性菌具有极强的杀伤作用，这个短杆菌肽后来被证实是一种由L-型及D-型氨基酸交替组成的N-甲酰化多肽，是首个明确一级结构的抗菌肽（朱钧萍等，2013）。1962年，国外科学家在研究蟾蜍的皮肤分泌物时，发现了一种未知的可以抗菌的物质，经分析是一种肽类物质。1963年，首次从酿酒酵母中发现嗜杀毒素。1972年，瑞典科学家Boman等在惜古比天蚕（Hyalophora cecropia）中发现了一类肽类物质，称为天蚕素（cecropin），并确定了天蚕素A和天蚕素B的一级结构顺序（Boman，1995）。此后，人们又相继在细菌、真菌、两栖动物、哺乳动物、植物和人类中发现并分离得到了相似的抗菌肽类物质，并称为抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）。Lee等（1997）从柄海鞘（Styela clava）的血细胞中分离得到的clavanin是α螺旋抗菌肽的典型代表。clavanin含有1~2个α螺旋结构，不含半胱氨酸残基，其抗菌活性很高，对哺乳动物无细胞毒性。杜卫等（2000）利用RP-HPLC从栉孔扇贝中分离得到4个小分子多肽。
到目前为止，已经鉴定出来2000多种抗菌肽，并且每年都以很高的速度增长。这些抗菌肽来自脊椎动物、无脊椎动物、微生物和人类。据统计，在所发现的抗菌肽中，绝大多数为阳离子型抗菌肽，这些阳离子型抗菌肽具有广谱的抗微生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒、抗肿瘤等。
随着科学界对抗菌肽研究的不断深入，人们发现抗菌肽是自然界长期进化而来的，存在于很多生物体内的一种天然物质，具有非特异性抗病原微生物作用、天然免疫调节作用和其他多种生物活性功能，是生物非特异性免疫防御系统的一个重要组成部分，是一种天然抗病因子。随着对抗菌肽作用与功能研究和发现的增多，也有将抗菌肽重新命名为“抗微生物肽”、“防御素”和“宿主防御肽”的情况。
近几年来，抗菌肽的研究在理论和应用上不断得到拓展，抗菌肽的高效广谱抗病原微生物作用和对提高动物免疫力的显著作用，得到了实验室及临床使用的大量验证。目前，Genarea公司的Pexiganan已用于治疗糖尿病足部溃疡，Xoma公司开发的XMP.629和Neuprex分别用于治疗痤疮、脑膜炎，这几个抗菌肽均已通过临床Ⅲ期试验。抗菌肽的优越性能显示了其巨大的应用前景。
但是，常态下动物体内抗菌肽的含量极低，分离提取难度极高，仅适合实验室研究使用，无法大规模工业化生产，高昂的天然抗菌肽获得成本制约了抗菌肽的实际应用。而通过基因工程技术进行抗菌肽的大规模表达，获得效价高、性能稳定的抗菌肽产品是一条切实可行的途径。
第二节 抗菌肽的分类
一、根据抗菌肽结构与氨基酸序列分类
1. β折叠抗菌肽
β折叠型抗菌肽具有反平行的β折叠结构，在分子内含有2~6个二硫键，二硫键存在于两个构成β折叠的肽段之间，起到稳定抗菌肽结构的作用，也有助于抗菌肽穿过细胞膜，但对抗菌肽的抗菌活性没有影响[图1-1（a）]。利用X射线晶体衍射研究人中性粒细胞中分离到的防御素（HNP-2）的结构时发现，在晶体状态下，防御素是以二聚体形式存在的，每个单体都有3股反平行的β折叠片以二硫键连接，不对称的2个单体分子紧密靠近，并与二次旋转轴对称。
图1-1 抗菌肽的结构示意图
（a）β折叠结构；（b）α螺旋结构；（c）伸展螺旋结构；（d）环状结构
具代表性的β折叠型抗菌肽是鲎素，它是从日本鲎红细胞中提取的，由17~18个氨基酸残基组成，在残基3~8和16~11之间构成反平行β折叠结构，残基3和16及7和12之间形成两个二硫键。
动物防御素也是β折叠型抗菌肽。β-防御素广泛存在于不同的上皮组织中，可能参与上皮和黏膜的抗感染防御。
2. α螺旋抗菌肽
α螺旋抗菌肽含有一个跨膜的α螺旋结构[图1-1（b）]，这个跨膜的α螺旋结构自身或者螺旋结构聚合体介导抗菌肽诱发细菌内容物的泄漏，使细胞死亡。在螺旋结构中间含有小的弯曲。α螺旋抗菌肽不含半胱氨酸，不形成分子内二硫键，N端富含亲水性碱性氨基酸残基，如赖氨酸和精氨酸，所带正电荷有利于与细菌膜上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附到细菌膜上，C端含较多的疏水性氨基酸残基，疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。分子的两端各形成一个两亲性α螺旋，2个α螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，这种α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构，当抗菌肽结合到细菌细胞膜上时，α螺旋相互聚集使细胞膜形成孔洞，细胞质外溢而致细菌死亡。
这类抗菌肽的代表是magainin（根据读音翻译为“马盖宁”；其他译名还有爪蟾抗菌肽、蛙皮素，容易使人混淆，故后文均使用英文表示），它是从蟾蜍皮肤中分离得到的，由23个氨基酸残基组成，其中在12及13位氨基酸残基附近出现一个弯曲结构。在目前发现的所有的抗菌肽中，α螺旋抗菌肽的数量是最多的。
3. 伸展螺旋型抗菌肽
这类抗菌肽的氨基酸序列中不含半胱氨酸，但富含脯氨酸、精氨酸、色氨酸和甘氨酸，一般含有15~34个氨基酸残基[图1-1（c）]，在两性分子内部形成分子内的α螺旋，不含取代基结构，含有糖基化位点，这些位点与其生物功能密切相关。这类抗菌肽主要通过肽与膜脂间的氢键或范德华力，而不是残基间的氢键来发挥抗菌作用。
从牛中性粒细胞中分离的indolicidin抗菌肽只含有13个氨基酸残基，其中包含5个色氨酸，它们位于多肽结构的中心，对抗菌活性起着关键的作用。另外，蜂毒肽（melittin）富含甘氨酸。从蜜蜂体内分离到的蜜蜂源抗菌肽（apidaecin）中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33%和17%。昆虫防御素首先从肉蝇中分离得到，当时认为与哺乳动物的防御素具有高度同源性而命名为昆虫防御素（insect defensin）。但后来的研究表明，昆虫防御素与哺乳动物防御素二硫键的连接方式，以及三维空间构型是截然不同的。
4. 具环状结构型抗菌肽
这类抗菌肽在C端有一个分子内二硫键，形成一个环链结构，而N端则为线状结构[图1-1（d）]。这一类抗菌肽有较强的抗菌活性。
青蛙皮肤细胞产生的brevinin和牛的抗菌肽bactenecin均属于此类。但是，牛中性粒细胞分泌的bactenecin是在分子的中部形成一个环链，两端有1或2个游离的残基。
5. 无规则结构的抗菌肽
这类抗菌肽的结构与规则的α螺旋或β折叠不同，呈现无规则卷曲，富含一个或多个特殊氨基酸，有的呈伸展螺旋状。例如，从凡纳滨对虾血细胞中分离的penaeidin（一种类型的对虾肽）富含脯氨酸，这些脯氨酸无规则地排列，形成一个无规则的卷曲结构。
二、根据是否为天然来源分
1. 天然来源抗菌肽
从生物体内分离到的抗菌肽为天然来源抗菌肽。迄今，科学家已经从细菌、真菌、高等植物、昆虫、两栖动物、软体动物、甲壳动物、鱼类、鸟类、哺乳动物乃至人类中分离出上千种抗菌肽，这些都是天然来源的抗菌肽，产量极低。
2. 合成抗菌肽
通过化学合成技术或基因工程技术获得的抗菌肽属于合成抗菌肽。这类抗菌肽比天然抗菌肽的活性高、稳定性强和抑菌谱广。
三、根据电荷分
按照抗菌肽分子表面的电荷的不同，主要将抗菌肽分为阳离子抗菌肽和阴离子抗菌肽。
1. 阳离子抗菌肽
阳离子抗菌肽在抗菌肽中占绝大多数。不同多肽的精氨酸和赖氨酸的数目不同，但至少有一个净的二价正电荷。阳离子多肽在正常pH条件下均带有正电荷。阳离子抗菌肽如LL-37、cecropin、magainin、凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin-1~ penaeidin-3等。
2. 阴离子抗菌肽
阴离子抗菌肽在抗菌肽中为数不多，在生理pH条件下带负电荷，如从细角滨对虾血浆中分离的PsHct1和PsHct2，以及羊呼吸道组织中的表面活性物质相关阴离子抗菌肽（surfactant-associated anionic peptide，SAAP）。
四、根据来源物种分
1. 微生物源抗菌肽
这类抗菌肽能杀死或抑制竞争菌，对抗菌肽产生者自身却无害，主要包括细菌素、酵母嗜杀毒素和病毒源抗菌肽。
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