为研究冷诱导转录因子CBF1（C-repeat-binding-factor）基因对我国优良豆科牧草紫花苜蓿的抗寒性改良作用，本书介绍了以紫花苜蓿品种‘中苜1号’‘公农1号’和‘猎人河’为受体材料，采用农杆菌介导法将拟南芥冷诱导转录因子CBFl基因转入其中获得了转基因紫花苜蓿植株，PCR和RT-PCR检测结果表明．目的基因CBF1已经整合至紫花苜蓿基因组中并在其转录水平表达，抗寒生理指标测定结果表明转CBF1基因紫花苜蓿的抗寒性得到提高。这为下一步选育紫花苜蓿抗寒新品种奠定了良好的基础。 全书共分6部分，主要内容包括：引言，紫花苜蓿高效组培再生体系建立，拟南芥CBF1和CBF4基因克隆及植物表达载体构建，紫花苜蓿农杆菌遗传转化及转化植株的分子生物学检测，转基因紫花苜蓿抗寒性鉴定。结论与今后研究方向。 本书具有较强的系统性和创新性，可作为研究苜蓿组织培养和遗传转化等本科生和研究生的参考教材，也可供相关专业科研和教学参考。

1 引言
1.1 苜蓿概况
1.2 苜蓿属牧草国内外育种研究进展
1.3 苜蓿属牧草基因工程研究进展
1.3.1 紫花苜蓿基因工程研究进展
1.3.2 黄花苜蓿基因工程研究进展
1.3.3 转基因苜蓿安全性问题
1.3.4 转基因苜蓿发展趋势和应用前景
1.4 CBF基因研究进展
1.4.1 CBF基因简介
1.4.2 CBF基因结构关系
1.4.3 CBF基因的表达
1.4.4 CBF基因作用机理
1.4.5 国内CBF基因的研究与应用
1.4.6 国外CBF转录因子的研究与应用
1.4.7 CBF转录因子的应用前景
1.5 研究目的及意义
1.6 研究内容及技术流程
2 紫花苜蓿高效组培再生体系建立
2.1 材料
2.1.1 供试植物材料
2.1.2 培养基
2.2 方法
2.2.1 无菌苗培养
2.2.2 外植体制备
2.2.3 愈伤组织的诱导
2.2.4 愈伤组织的继代
2.2.5 愈伤组织的分化
2.2.6 生根培养
2.2.7 评价指标
2.3 结果与分析
2.3.1 愈伤组织诱导培养基的选择
2.3.2 继代培养基的选择
2.3.3 分化培养基的选择
2.3.4 外植体的选择
2.3.5 基因型的选择
2.3.6 苜蓿转化植株的生根培养
2.4 小结
2.5 讨论
2.5.1 基因型对愈伤组织分化的影响
2.5.2 外植体对愈伤组织分化的影响
2.5.3 AgNO3对胚性愈伤率的影响
2.5.4 TDZ对胚性愈伤率的影响
2.5.5 KT对愈伤组织分化的影响
3 拟南芥CBF1和CBF4基因克隆及植物表达载体构建
3.1 材料
3.1.1 拟南芥简介
3.1.2 拟南芥作为一种模式植物的优点
3.1.3 大肠杆菌
3.1.4 酶以及试剂
3.2 主要仪器
3.3 常用溶液的配制
3.3.1 溶液的配制
3.3.2 实验试剂的配制
3.3.3 PCR反应
3.4 实验方法
3.4.1 引物的筛选
3.4.2 从基因组中克隆目的基因
3.4.3 植物表达载体的构建
3.4.4 质粒转化农杆菌的电击转化
3.5 结果与分析
3.5.1 引物筛选结果
3.5.2 CBF1基因片段的克隆及序列分析
3.5.3 CBF1-PRO启动子片段的克隆及序列分析
3.5.4 CBF1启动子功能预测分析
3.5.5 CBF4基因片段的克隆及序列分析
3.5.6 PBI121-CBF1植物表达载体的构建
3.5.7 PBI-PRO-CBF1植物表达载体的构建
3.5.8 PBI121-CBF4植物表达载体的构建
3.6 小结
3.7 讨论
4 紫花苜蓿农杆菌遗传转化及转化植株的分子生物学检测
4.1 材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株和质粒
4.1.3 培养基
4.2 方法
4.2.1 抗生素类型选择及浓度确定
4.2.2 确定Kan筛选压实验
4.2.3 不同基因型苜蓿对转化的影响
4.2.4 紫花苜蓿外植体类型对转化的影响
4.2.5 农杆菌菌液浓度与转化效率关系
4.2.6 侵染时间和转化效率的关系
4.2.7 AS浓度与转化效率的关系
4.2.8 紫花苜蓿遗传转化再生植株的获得
4.2.9 植物基因组RNA提取
4.2.10 再生植株PCR检测
4.2.11 转化植株CBF1基因转录检测
4.3 结果与分析
4.3.1 选择抗生素种类及确定最佳浓度
4.3.2 选择培养中选择压的确定
4.3.3 不同基因型紫花苜蓿对转化率的影响
4.3.4 紫花苜蓿不同外植体对遗传转化影响
4.3.5 农杆菌菌液浓度对苜蓿外植体转化率的影响
4.3.6 农杆菌侵染时间对转化率的影响
4.3.7 共培养基AS浓度对转化率的影响
4.3.8 紫花苜蓿抗性转化植株的获得
4.3.9 转化植株的PCR鉴定
4.3.10 转化植株的RT-PCR鉴定
4.4 小结
4.5 讨论
4.5.1 农杆菌菌株对转化的影响
4.5.2 Kan对转化效率的影响
4.5.3 侵染时间对转化效率的影响
4.5.4 AS对转化效率的影响
4.5.5 转化植株的鉴定
5 转基因紫花苜蓿抗寒性鉴定
5.1 材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 叶片处理
5.1.3 整株处理
5.2 方法
5.2.1 游离脯氨酸测定
5.2.2 丙二醛含量测定
5.2.3 可溶性糖含量测定
5.2.4 相对电导率测定
5.2.5 人工模拟寒冻天气整株寒冻法测定
5.3 结果与分析
5.3.1 低温胁迫下转基因苜蓿相对电导率分析
5.3.2 低温胁迫下转基因苜蓿脯氨酸含量分析
5.3.3 低温胁迫下转基因苜蓿可溶性糖含量分析
5.3.4 低温胁迫下转基因苜蓿丙二醛含量分析
5.3.5 低温胁迫下人工模拟寒冻天气分析
5.4 小结
5.5 讨论
5.5.1 转入抗寒基因后苜蓿植株耐寒生理检测指标筛选
5.5.2 转入抗寒基因后苜蓿植株抗寒性直接鉴定法选择
6 结论与今后研究方向
6.1 结论
6.2 今后研究方向
主要参考文献
缩写表