第一章 环境微生物分子检测技木
第一节 环境样品DNA的提取
一、概述
微生物分子生态学是通过分析样品中DNA分子的种类、数量等基因组信息来反映微生物种群结构等信息的。用分子生物学方法对环境微生物多样性、群落结构及变化规律的研究近年来得到快速发展，已成为最富于活力的生态学科前沿领域之一，因此对环境样品中的细菌基因组DNA组成状况进行分析评价，必须建立高效、可靠的DNA提取方法。由于环境样品中微生物的种类组成复杂且常常混杂有大量有毒物质，如何使所有细胞裂解、充分释放DNA并有效去除杂质，得到可以进行分子生物学操作的高纯度DNA是研究环境样品中微生物种群结构与功能关系的关键所在。因此，应用分子生物学技术分析复杂的基因组，首先必须制备高纯度的DNA。环境样品的微生物总DNA的提取和纯化方法主要由两部分组成：①温和裂解细胞及溶解DNA的技术，包括通过物理、化学或酶解作用裂解细胞，使DNA释放出来。常用的物理方法包括煮沸、冻融、微波、超声、研磨等，化学方法包括高盐、表面活性剂SDS、热酚等，酶解法包括裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等。②在环境样品DNA得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA及其他的大分子。
一般传统的DNA制备方法是依赖上述方法裂解细胞，某些情况需要用酶来消化蛋白质或降解一些细胞组分，然后细胞材料用溶剂抽提，通常为酚/氯仿。分离成两相后，核酸存留在水相中。核酸进一步纯化可用乙醇沉淀法，再重新溶解在适宜的缓冲液中。用这些技术得到的DNA是高纯度的，并适用于大部分分子生物学操作。近年来，色谱技术在DNA提取中的应用打破了传统方法的统治地位，这些新的方法主要有螯合树脂／纯化柱法、玻璃粉吸附法、磁珠吸附法、免疫亲和法等。
实际上分子生物学的所有方法从某种程度上都需要进行核酸的分级分离（表1—1）。色谱技术对于某些应用是合适的，比如分离双链核酸和单链核酸、分离质粒与基因组DNA以及从细胞裂解物碎片中分离基因组DNA。然而，凝胶电泳法比其他方法具有更高的分辨率，因而成为一般情况下首选的分离方法。凝胶电泳分离法既可以是分析型的，也可以是制备型的，分离片段的分子质量范围在1000～108Da之间。
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