3.3随机扩增多态性DNA
williams等(1990)在PcR的基础之上,分别提出了另一种DNA多态性检测技术,命名为随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolyIIlOlphicDNA,RAPD)。RAPD技术是20世纪90年代发展起来的、建立在PcR技术基础上的一种分子标记手段。它利用一系列不同随机排列的10个碱基组成的寡核苷酸单链为引物,以生物的基因组DNA为模板进行PcR(与常规PcR相比,退火温度较低,一般为36℃)扩增。当模板上有引物的结合位点,并且一定范围内有与引物互补的反向重复序列时,此范围内的DNA片段就可以被扩增出来,RAPD带的多态性是由引物与模板的结合位点数及可扩增区域片段的长度决定的,基因组的遗传变异通过琼脂糖凝胶电泳检测RAPD产物的多态性获得。RAPD分析可在所有生物的基凶组中进行,所需模板量少,由于是低温退火,在一定程度上提高了检出分辨率,能够方便、快速地检出不同个体间的遗传差异。增加引物种类数还可以增加遗传变异检出率。它能检出RFLP技术所不能检出的重复顺序区;事先未知研究对象的任何遗传背景,亦可提供大量位点上的非细节信息。另外,实验程序简单灵敏,安全快速,花费不高,具有良好的可操作性和实用性。但是,RAPD标记为显性标记,不能有效地鉴定出杂合子,结果导致分析中的序列同源假设(长度相等的扩增片段视为同源性片段)可能会高估不同样本问的亲缘关系。此外,RAPD还极易受反应条件的影响,不同实验室和不同实验条件下的结果不一致,而且RAPD的单带有可能是多个分子的混合物。这是目前RAPD技术在应用上存在争议的原因。
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