第1章 粮食及其制品中真菌毒素快速定性与精准定量分析
1.1 样品前处理
样品前处理是样品分析中的关键步骤之一，旨在消除基质干扰、提升方法的精密度、准确度、灵敏度和选择性，是确保检测结果可靠、准确的重要前提。前处理过程包括样品制备、提取、分离纯化和浓缩等步骤，以便在复杂基质中*大限度地提取待测组分，进而进行定性和定量分析（崔东伟，2021）。谷物及其制品常含有蛋白质、油脂等杂质，基质复杂，但真菌毒素的含量极少。因此，实现真菌毒素的精准检测依赖于高效、快速的前处理方法。目前，真菌毒素的前处理方法主要包括液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取（solid-phase extraction，SPE）、QuEChERS、凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography，IAC）和免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）等技术。
LLE是一种传统的提取方法，广泛应用于真菌毒素的萃取，具有操作简单、通用性强等优点（Yu et al.，2023）。其原理是通过样品中不同组分在两种不相容液相中的溶解度或分配系数的差异实现目标化合物的分离和富集，常用乙腈/水或甲醇/水体系（Antony et al.，2021）。尽管LLE操作简单便捷，但存在有机溶剂消耗大、难以满足高通量检测需求以及目标物易流失等缺点（Badawy et al.，2022）。通过添加无机盐（如NaCl）提升分配系数，LLE的萃取效率可进一步提高（Bokhary et al.，2021）。例如，Salim等（2021）将LLE应用于米糠中黄*霉毒素（aflatoxins，AFs）和赭*霉毒素（ochratoxins，OTs）等多种真菌毒素的同时检测，获得了较高的提取回收率和良好的线性关系。Slobodchikova和Vuckovic（2018）将乙酸乙酯用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和黄*霉毒素B1（AFB1）等17种真菌毒素的萃取，大幅降低了基质效应且无需免疫亲和柱，降低了检测成本。
SPE基于吸附剂的特性实现目标化合物与干扰物的有效分离，随后用合适的洗脱液将目标化合物从固体吸附剂中洗脱，完成分离和富集（孙学丽和王丽娟，2022）。作为一种广泛应用的传统吸附萃取技术，SPE具备高效、稳定、重现性好等优点（姚建华，2020），但其溶剂和样品消耗量较大，检测成本较高（邓龙等，2023）。与LLE相比，SPE可以依据目标物的结构和样品基质的特点选择合适的吸附剂，在目标分析物的富集和纯化方面效果更佳（崔东伟，2021）。例如，Yu等（2023）利用亲水-疏水平衡SPE柱从水果中提取真菌毒素，平均回收率达85%～108%。黄忠亮等（2024）建立了结合自动SPE的液相色谱-串联质谱法测定杂粮中14种真菌毒素，结果表明检测灵敏、准确，适用于多种谷物样品。
QuEChERS是一种新型的快速样品前处理技术，具有快速（quick）、简便（easy）、便宜（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）、安全（safe）等特点（李俊超等，2021）。其方法简单，样品经有机溶剂提取后，用盐析或离心除水，再用乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶等吸附剂净化（孙学丽和王丽娟，2022）。QuEChERS具备溶剂用量少、回收率高等优势，特别适用于食品基质中真菌毒素的提取（崔东伟，2021）。例如，在对坚果中真菌毒素的定量研究中利用QuEChERS方法，能有效地减少基质效应，同时实现溶剂用量少和较高的回收率（75%～98%）（Alcántara-Durán et al.，2019）。殷锡峰等（2024）利用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测多种粮食作物中7种真菌毒素残留，方法快速、灵敏度高，适用于多种基质样品。Miró-Abella等（2017）则利用该技术分析了植物型饮料中的AFs和其他毒素，回收率达80%～91%，结果良好。
GPC基于分子量筛分原理，通过不同分子量物质在多孔聚合物凝胶中的滞留时间差异，实现待测物与基质的有效分离（何丽，2024）。GPC的填料通常选用交联聚苯乙烯二乙烯基苯，具有较强的热稳定性、化学惰性和优良的力学性能；在流动相选择方面，多使用无水乙腈、甲苯或其他有机溶剂，以确保溶剂毒性低、化学性质稳定。GPC的优势在于操作效率高、适用范围广、可重复试验且具有较大的净化容量（傅小红，2022）。例如，Kholif等（2021）将GPC用于油料种子中AFs的检测，验证出玉米谷物中AFs污染的风险更高，并为AFs风险评估和管理提供了有效支持。
IAC技术基于生物大分子之间的特异性识别和可逆结合，将抗体固定于固定相载体上，以实现目标物与干扰物的高效分离，进而确保检测结果的准确性（桑晓霞等，2019）。IAC多针对单一种类真菌毒素净化，通用性较差且不适合高通量检测（牛灿杰等，2023），但是在复杂基质中可实现目标物的高效富集和纯化，并减少有毒试剂的使用，具有绿色环保和特异性强等优点（戴宇琪等，2024）。例如，Wang等（2024）使用免疫亲和柱对食品和饲料样品中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）进行检测，展现出良好的回收率（92.46%～105.48%）和可接受的相对标准偏差。刘飞等（2021）利用IAC在线净化富集饲料中的4种AFs，回收率为94.6%～114.3%，显示出良好的净化效果和较短的分析时间。Naomi等（2022）则采用多抗体IAC净化饲料中多种真菌毒素，无需同位素标记或基质匹配液即可实现准确定量，回收率为74%～117%。
IMBs是一种新兴的生物技术，通过将抗体与磁性材料（如Fe3O4纳米颗粒）偶联形成定向固定化的免疫磁珠，在外加磁场作用下实现样品的特异性净化与富集（Zhang et al.，2021a）。IMBs操作简便快捷，且具有较高的特异性。然而，高质量商业化免疫磁珠依赖进口，成本较高，限制了其广泛应用（侯广月等，2019）。Huang等（2021）将抗体与磁珠结合制备了灵敏且特异性强的免疫磁珠，开发了一种高效的酶联免疫检测方法，用于稻黑粉菌素的检测，对稻黑粉菌素A、B和G的灵敏度分别为0.15μg/mL、0.14μg/mL和0.04μg/mL。韩祎陟等（2024）则通过免疫磁珠净化结合高效液相色谱，检测植物油中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，以甲醇-水溶剂（70︰30，体积比）提取，经AFs免疫磁珠净化后，结合自动工作站提升了净化效率，在植物油样品中4种毒素的回收率达74.0%～96.0%，相对标准偏差均小于7.0%。该方法在准确性、灵敏度上与国家标准方法（GB5009.22—2016）无显著差异，适用于植物油中多种AFs的定量分析。
综上所述，食品中真菌毒素检测的前处理方法不仅是保障食品安全检测准确性的基石，亦是推动食品安全科技进步的重要驱动力。随着研究的深入与技术的创新，已经形成了一系列高效多样的前处理技术，每种方法在特定应用领域发挥了不可替代的作用。然而，面对日益复杂的食品基质和真菌毒素种类的增加，仍需持续创新与探索，加强跨学科协作，深化基础研究，开发出更加高效、便捷和环保的前处理方法，以适应未来的检测需求。
1.2 快速免疫分析
目前，大多数真菌毒素的定量检测以仪器分析法为主，如液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱等仪器分析方法。虽然仪器法分析精确，但其样品前处理方法相对复杂，检测成本高且耗时长，并不适于大量样本的高通量检测。快速检测方法具有快速、灵敏等优点，越来越受到大众关注。同时，实时现场快速检测，有效提高了监控的时效性。而且随着单克隆抗体技术的出现，基于抗原和抗体的免疫学快速检测技术，逐渐成为检测领域的研究热点。基于免疫学的真菌毒素快速检测方法主要有以下几种。
1.2.1 酶联免疫吸附分析
酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是***的免疫检测方法，其特点是准确、特异、快速且检测成本低廉，在临床诊断和食品安全领域应用广泛。目前对单种及多种的真菌毒素ELISA均有报道。由于真菌毒素分子量较小，ELISA检测主要采用竞争法进行测定。特别地，近年来一些研究引入了新型材料使免疫检测方法更为灵敏。Xu等（2021）建立了基于金属有机框架的ELISA，用于AFB1的高灵敏检测，方法平均回收率为91.8%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为6.20%，均优于传统ELISA（平均回收率为78.6%，RSD为11.65%）。
1.2.2 免疫胶体金试纸条
免疫胶体金技术是市场上比较热门的一种新型快速检测技术。在真菌毒素检测的应用方面十分广泛，常被应用于大批量样品快速现场检测，具有广泛的开发前景。该技术是将特异性真菌毒素抗原固定于膜上，胶体金标记特异性抗体置于结合垫上，当待检样本加到样本垫上，待测物与结合垫上的胶体金标记抗体反应，通过毛细作用共同向前移动，当移至真菌毒素抗原的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留在检测带上显现出颜色。关于真菌毒素相关的免疫胶体金技术检测报道包括单种和多种真菌毒素的定性及定量检测。
免疫胶体金技术应用于单种真菌毒素的报道比较普遍，Hu等（2018）用开发的免疫胶体金试纸条检测中药材中的AFB1，具有快速、灵敏、肉眼可读结果、操作简便、无需仪器等优点，适用于多种药材中AFB1的现场快速筛查。Yao等（2017）基于金标记单克隆抗体开发了免疫胶体金试纸条，用于同时检测玉米中的伏马毒素B1、B2和B3，检测限为11.24ng/mL，与高效液相色谱法结果具有良好的相关性，证明了其在现场快速检测玉米中多种伏马毒素的潜力。Pan等（2020）利用胶体金纳米粒子和纳米棒作为信号标记，开发了检测谷物中ZEN的免疫层析试纸条。该试纸条检测限为5.0μg/L，对ZEN具有高特异性和灵敏度，能在10min内完成检测，且与商业ELISA试剂盒结果一致，适用于谷物样品中ZEN的快速筛查。
1.2.3荧光免疫分析
荧光免疫分析方法基于抗原与抗体的特异性反应，以荧光素、量子点、量子点微球及时间分辨荧光微球等荧光标记物作为信号探针，实现灵敏且准确的检测。
1.荧光免疫吸附测定法
荧光免疫吸附测定（FLISA）是荧光分析技术与免疫分析方法结合的**应用。Li等（2022）利用双量子点纳米粒子，开发了FLISA技术，用于同时检测饲料中的AFB1和ZEN。该方法的检测限分别为9.3pg/mL和102.1pg/mL，回收率为82.50%～116.21%，与液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法的结果高度一致。类似地，Zhou等（2021）采用双量子点标记，开发了用于检测玉米中ZEN和OTA的方法，检测限分别为0.0239ng/g和2.339ng/g，ZEN的回收率为93.15%～101.90%，OTA的回收率为95.29%～102.43%。该方法与高效液相色谱（HPLC）的检测结果相符，可用于多种毒素的检测。
2.荧光定量免疫层析法
荧光定量免疫层析法基于荧光标记物与抗原、抗体的特异性结合，通过追踪化学反应的全过程实现定性与定量分析。Anfossi等（2018）开发了一种荧光定量免疫层析法，该方法利用量子点荧光被金银纳米颗粒猝灭的现象，通过竞争性免疫反应对靶标真菌毒素进行灵敏检测，其检测限为传统比色法的1/4。Hou等（2020）进一步开发了一种基于量子点纳米珠的荧光免疫层析试纸条，用于同时定量检测粮食中的伏马毒素B1、DON和ZEN。此方法对三种毒素的检测
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