本书是关于紫花苜蓿基因型（品种）与根瘤菌生物型（根瘤菌株）共生种质创新构建和共生效应代际传递的系统性研究成果论著，按照两类生物共生进化和促进苜蓿生长的需要及变异、遗传、选择的思路，将苜蓿与根瘤菌的共生表型性状直接作为选择对象，强化和固定对苜蓿提质增产有利的共生性状变异，培育共生效应代际“可遗传性”组合品种。具体内容包括苜蓿与根瘤菌共生研究现状和共生育种概念、苜蓿与根瘤菌共生遗传学基础、功能型根瘤菌资源筛选、特异根瘤菌种质创新、苜蓿与根瘤菌高效共生匹配性选择机制、种子内生根瘤菌共生体构建调控、内生根瘤菌种子贮藏方法与条件、内生根瘤菌种子共生效应代际传递与检测等。 本书适合草学、植物学和微生物学等学科领域的科研和教学人员阅读，可供草业、农业和林业领域技术人员参考。

第一章苜蓿与根瘤菌共生研究现状
　　第一节苜蓿根瘤菌
　　根瘤菌（Rhizobium）是与豆科植物共生形成根瘤，将大气中的无机氮固定转化为有机氮，从而供给植物营养的一类有益细菌。根瘤菌既可在土壤中生存，又能在植物组织内定植，增强植株的生物抗性（Pavlo et al.，2011）和非生物抗性（Miliute et al.，2015）。豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界中效率*高的固氮系统，不仅能提高豆科植物产量和品质，而且能改善土壤结构和提升土壤肥力。
　　苜蓿与根瘤菌的共生固氮作用对苜蓿产量和品质的提升至关重要，草地畜牧业发达国家播种苜蓿普遍进行根瘤菌接种。为了满足苜蓿播种对根瘤菌的需要，各国十分重视根瘤菌资源的采集与保藏，许多苜蓿品种都配备有与之相适应的优良根瘤菌种，菌种资源与苜蓿种质资源同样得到长期有效的保护和利用。
　　我国对根瘤菌的研究始于1950年（王卫卫等，2002），起初以引进国外根瘤菌剂应用为主，而苜蓿等豆科牧草根瘤菌的大面积应用研究，是20世纪80年代初我国开展大面积飞机播种豆科牧草之后才开始的，也是从那时起，我国开始立项进行豆科牧草根瘤菌筛选与利用研究。中国农业微生物菌种保藏管理中心根瘤菌实验室与全国各有关基层草原站协作从20个省份的60多个县采集根瘤及土样1000多份，获得原始分离物3000多份，经鉴定和筛选获得共生固氮性能优良根瘤菌菌种561株，其中苜蓿根瘤菌有252株，分别来自内蒙古、黑龙江、甘肃、青海、新疆、河北、山东7个省（自治区）的30个紫花苜蓿（Medicago sativa）品种、2个扁蓿豆（Medicago ruthenica）品种、5个草木犀（Melilotus officinalis）品种等宿主植物，而且来自不同地区、不同土壤和不同品种的根瘤菌生理生化特征间的差异很大。
　　中国农业大学生物学院陈文新院士研究团队对全国27省的豆科植物结瘤情况进行了全面调查研究，从根瘤中分离出与豆科植物共生的根瘤菌4000多株，是目前国际上菌株数量*大、宿主*多样的根瘤菌库，并对其中1000多株菌进行了性状分析和分类研究，发表过2个新属，7个新种，并发现了一批抗逆性强（抗酸、抗碱、抗盐、耐高温或低温）的重要根瘤菌种质资源。王卫卫等（2002）对甘肃、宁夏部分地区根瘤菌资源进行了调查，调查豆科植物36属99种，获得根瘤菌360株，44株是从尚未报道结瘤的30种豆科植物中分离得到的，其中，调查的苜蓿属（Medicago）植物5种，菌株数33株；草木樨属（Melilotus）植物4种，菌株数18株。
　　上述菌种资源被根瘤菌剂生产厂、农业院校和科研单位广泛利用，国家863计划项目也采用其中一些菌株（ACCC17512、ACCC17513、ACCC17517、ACCC17518、ACCC17519）开展基因工程菌的研究，这些菌种成为我国苜蓿共生固氮研究及接种剂生产的主要菌种来源，并在中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏，其中有一部分以ACCC编号编入1991年出版的《中国农业菌种目录》和1992年出版的《中国菌种目录》。根瘤菌菌种资源目前的保藏方法主要有真空冷冻干燥保藏、琼脂斜面石蜡油覆盖保藏和液氮超低温保藏。
　　根瘤菌在苜蓿植株上的结瘤和固氮受多种因素的影响，其中包括内在因素和外在因素。内在因素主要包括苜蓿品种和根瘤菌种（基因型），只有专一匹配的苜蓿品种与根瘤菌组合才能顺利结瘤，构成高效固氮体系。外在因素主要包括土壤理化因子、草地种植年限、播种方式、根瘤菌剂接种方式和土著根瘤菌等，因此筛选或创制优良的高竞争性苜蓿根瘤菌和研究根瘤菌接种技术非常重要。内生根瘤菌的发现为根瘤菌资源的开发和根瘤菌应用技术的提升开辟了新的方向。
　　第二节苜蓿内生根瘤菌
　　植物内生菌（endophyte），是指从表面消毒的植物组织中分离获得，能够定植在健康植物细胞间隙或细胞内，并未对宿主植物引起明显感染症状的一类微生物群（邓墨渊等，2006）。内生菌在植物体内的分布具有普遍性和多样性，几乎所有植物的根、茎、叶、花、果实等器官和组织细胞内都含有内生菌。植物内生菌主要包括真菌和细菌（Kumar and Hyde，2004；张雷鸣等，2014；郑有坤等，2014）。植物内生菌与其宿主之间存在着相互依存及互惠的关系，如内生细菌在植物体内不仅积极地生存着，而且还可以起到固氮、促进植物生长、防治病虫害等多种生物学作用（Fioreand Gallo，1995）。
　　1992年，Khush和Bennett研究发现埃及尼罗河三角洲地区三叶草和水稻长期轮作后的水稻根内可检测到三叶草根瘤菌，反复的实验室和大田试验证明根瘤菌作为内生菌与水稻有着天然的联合作用（Khush et al.，1992）。近些年来，全球对根瘤菌作为内生菌的研究越来越广泛，美国、英国、德国、法国、澳大利亚、意大利、西班牙、加拿大、菲律宾、摩洛哥、塞内加尔、墨西哥、肯尼亚、印度等的研究都表明根瘤菌也可侵入非豆科植物根内，在根的皮层细胞和细胞间隙及维管束中定植，外观上没有引起宿主植物的病理反应，但具有明显的促生作用（Yanni et al.，2001）。
　　内生根瘤菌不仅可侵染豆科植物，还可侵染包括玉米、水稻、莴苣、烟草在内的多种非豆科作物（Gutierrez-Zmaora and Martinez-Romero，2001），并可定植于植物的表皮、皮层及维管系统的细胞间隙和细胞内（迟峰，2006）。迟峰（2006）将携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的标记根瘤菌分别接种于水稻和烟草中，观察绿色荧光标记根瘤菌在植株体内的侵染规律和定植动态。结果发现，根瘤菌对水稻和烟草的侵染具有动态性，绿色荧光标记根瘤菌首先定植于植物根表皮及根毛中，然后逐渐定植于侧根裂隙处的表皮中，并由此大量进入根皮层，在细胞间隙和通气组织内大量繁殖。同时，定植于根内的荧光标记根瘤菌可向上迁移至茎，并在茎的细胞间隙中定植；根瘤菌还可定植于烟草叶片的叶肉细胞及细胞间隙且能够从烟草叶的气孔溢出到叶表，具有附生—内生—附生生活方式的转换（Chi et al.，2005）；在烟草的生殖生长阶段，根瘤菌仍可保持活动性，可进入子房壁、胎座和胚珠内（迟峰，2006）。这些结果暗示内生根瘤菌与植物的共生作用较复杂，具有动态的侵染能力，包括内生根瘤菌在植物地下和地上部分的定植和分布，且具有通过种子垂直传递给子代的能力（Chi et al.，2005）。
　　陈丹明等（2002）在筛选紫花苜蓿共生根瘤菌时发现对照（不接菌处理）出现结瘤现象，许建香（2004）在芸豆高效根瘤菌的筛选及分子标记研究中发现未接种的两个芸豆品种对照都结瘤，并且有少数菌株接种效果反而不如对照。以上两个发现说明苜蓿和芸豆种子中存在内生根瘤菌且具有一定的结瘤固氮能力。种子内生根瘤菌的研究与开发利用，既开创了根瘤菌资源研究的新途径，又开创了根瘤菌应用技术的新途径。但目前关于苜蓿植株内生根瘤菌及其数量动态规律、结瘤专一性、结瘤能力、种子内生根瘤菌垂直传递给子代的能力、固氮酶活性、固氮量缺乏系统性研究。
　　第三节共生效应
　　氮素供应不足是农业生产中普遍存在的问题，自从我国进入高质量发展阶段后，可持续发展强烈要求遵从绿水青山就是金山银山的发展理念，仅依靠化学氮解决作物提质增产既不现实，也不经济。
　　1886年，德国植物化学家H.Hellriegel和H.Wilfarth研究证明豆科植物能固定空气中的氮。1888年，荷兰学者M.W.Beijerinck从豆科植物根瘤中第一次分离出固氮细菌纯培养物，并命名为根瘤菌（Rhizobium）。从此，关于根瘤菌与豆科植物共生固氮的研究逐渐成为各国学者关注的焦点。共生固氮是指微生物与植物紧密生活在一起，由固氮微生物在与植物共生的状态下直接将大气中的分子态氮转化成化合态氮的过程。由共生体系的固氮作用产生的对共生双方生长的促进作用及对共生环境的改良作用即为共生固氮效应。苜蓿与根瘤菌共生固氮体系从空气中固定的总氮量达到200～400kg/hm2，极大程度上减少了化学肥料的使用，具有良好的经济和生态效益。
　　目前，人工接种根瘤菌是利用共生体系的固氮效应提高豆科作物和牧草产量及品质的重要方法之一，主要是指通过播种前拌种或制成包衣种子等方法人为将适宜的根瘤菌剂接种于豆科作物或饲料作物的一种技术措施。1895年，Nobbe和Hiltner首次开始进行豆科作物商业根瘤菌剂的生产，随后美国、加拿大和澳大利亚等国也在种植豆科作物时接种商业根瘤菌剂。我国从1980年开始进行豆科牧草根瘤菌资源的采集、鉴定、保藏、评价及利用研究，研制出多种商业根瘤菌剂产品。然而由于根瘤菌株与宿主的匹配性、自然环境差异、土著根瘤菌竞争及多种生物与非生物胁迫等因素的存在影响了目标根瘤菌在豆科植物根部侵染的成功率，所以目前人工接种根瘤菌剂的效果并不稳定。而且，单纯地通过“优良植物品种选育—匹配根瘤菌株筛选—根瘤菌剂研制—根瘤菌剂接种”的程序利用根瘤菌固氮，淡化了苜蓿基因型与根瘤菌生物型间的精准结合或专一识别过程，弱化了共生固氮体系中豆科植物与根瘤菌的微协调互作过程，限制了根瘤菌固氮潜力的充分发挥。
　　第四节共生育种
　　一、共生育种的概念
　　共生是两种密切接触的不同生物之间形成的互利关系。有的生物之间进化为要借助共生关系来维系生命，属于专性共生（obligate symbiosis）；有的生物之间的共生关系只是提高了共生生物的生存概率，但并不是必需的，属于兼性共生（facultative symbiosis）。共生关系有时是不对称的，很可能出现一种生物是专性共生而另一种生物是兼性共生的现象。植物与微生物的共生体系主要包括蓝藻共生体系（蓝藻与真菌、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物）、豆科植物共生体系（根瘤菌与豆科植物）、非豆科植物共生体系［根瘤菌与榆科植物及弗兰克氏放线菌属（Frankia）与桤木属、杨梅属、美洲茶属等植物］及丛枝菌根真菌共生体系（丛枝菌根与禾本科植物等）。
　　育种是通过创造变异、改良遗传特性，以培育优良生物新品种的技术。育种以遗传学为理论基础，需综合应用生态、生理、生化、病理和生物统计等多学科知识。植物育种又被称为以高产、稳产、优质、高效为目标的植物品种创制。目前的植物育种方法主要包括诱变育种、杂交育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程（转基因）育种、细胞工程育种和植物激素育种等。这些植物育种方法均是建立在植物种单独改造的原理之上，以植物自身的遗传基础或基因为研究对象，以植物变异群体（基因或基因组发生变化的群体）为材料，人工选择获得农艺性状优良稳定的植物品种。
　　共生育种是通过两种密切接触的不同生物之间形成的互利关系创造两种生物互利的变异，改良互利的遗传特性，以培育具有稳定遗传基础的优良共生生物新组合的技术。两种不同生物的共生育种有别于单种生物育种，是生物育种的新技术，对生物育种理论与技术的拓展具有十分重要的意义。
　　二、苜蓿与根瘤菌共生育种的理论基础
　　苜蓿与根瘤菌的共生育种以选育的优良苜蓿基因型品种和高效精准匹配的固氮根瘤菌生物型为材料，通过接种将目的根瘤菌生物型导入亲属关系密切的苜蓿基因型品种的植物组织中，利用根瘤菌在苜蓿植株体内的运移和定植特性建构内生根瘤菌种子，并使高效共生固氮特性通过种子在代际间稳定传递的育种方法。
　　实现苜蓿与根瘤菌共生育种的关键在于明确二者互利共生的具体方式。苜蓿与根瘤菌的共生方式主要包括：①结瘤共生，即根瘤菌在苜蓿植株上结瘤并在根瘤内与苜蓿进行的互利共生；②组织内生，即根瘤菌以内生菌的方式生活在苜蓿植株体内，并随着植株的生长不断运移和定植到苜蓿植株的不同部位；③联合共生，主要是指根瘤菌与土壤及根际中的丛枝菌根真菌等微生物联合起来，共同发挥固氮、促生、抗逆和土壤修复等作用（迟峰，2006）；④种子内生，即根瘤菌通过

目录　
第一章　苜蓿与根瘤菌共生研究现状　1　
第一节　苜蓿根瘤菌　1　
第二节　苜蓿内生根瘤菌　2　
第三节　共生效应　3　
第四节　共生育种　4　
一、共生育种的概念　4　
二、苜蓿与根瘤菌共生育种的理论基础　4　
三、苜蓿与根瘤菌共生育种的步骤　5　
第二章　苜蓿与根瘤菌共生的遗传学基础　6　
第一节　苜蓿与根瘤菌共生体系建立的基础　6　
第二节　苜蓿与根瘤菌专一性共生决定因子　6　
一、宿主植物专一性共生决定因子　7　
二、根瘤菌专一性共生决定因子　8　
第三节　苜蓿与根瘤菌高效共生体构建　11　
一、外源干预物质调控　11　
二、根瘤菌侵入植株体内的接种方法调控　15　
三、内生根瘤菌种子的贮藏条件　15　
四、荧光蛋白标记根瘤菌构建示踪菌株　16　
第四节　种子内生根瘤菌的传代　17　
第三章　干旱生境根瘤菌资源调查与功能型菌株筛选　19　
第一节　苜蓿根瘤菌资源调查及影响因子分析　19　
一、苜蓿根瘤菌资源的调查、菌株分离及回接鉴定　19　
二、苜蓿根瘤菌结瘤能力影响因子分析　21　
三、苜蓿种子内生根瘤菌资源筛选　26　
第二节　高效结瘤固氮根瘤菌株筛选　32　
一、苜蓿根瘤菌固氮能力研究及高效固氮菌株筛选　32　
二、苜蓿种子内生根瘤菌结瘤固氮能力及高效菌株筛选　38　
第三节　苜蓿根瘤菌的其他促进生长功能　43　
一、苜蓿根瘤菌溶磷和分泌生长素能力　43　
二、苜蓿种子内生根瘤菌的溶磷和分泌生长素能力　48　
第四节　苜蓿根瘤菌抗逆菌株筛选　50　
一、苜蓿根瘤菌抗逆能力及抗逆性菌株筛选　50　
二、苜蓿种子内生根瘤菌抗逆能力及抗逆菌株筛选　57　
第五节　复合功能根瘤菌种质资源筛选　61　
一、复合功能苜蓿根瘤菌　61　
二、复合功能苜蓿种子内生根瘤菌　62　
第四章　苜蓿根瘤菌种质创新　63　
第一节　荧光蛋白标记根瘤菌的构建　63　
一、荧光质粒导入大肠杆菌及其稳定性表达　63　
二、三亲本杂交法构建荧光标记根瘤菌　69　
三、荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长的影响　75　
第二节　解磷根瘤菌种质诱变选育　93　
一、解磷根瘤菌的逐级分离筛选　94　
二、解磷根瘤菌耐抗生素突变株的诱变选育　100　
三、解磷根瘤菌高效突变株对植物的促生效应研究　110　
四、解磷根瘤菌剂及抗污染剂型的研制　116　
第三节　耐植物苦参碱抑菌剂的根瘤菌种质创新　134　
一、抑菌剂对空气和土壤微生物的抑制及对苜蓿种子萌发的影响　134　
二、耐苦参碱抑菌剂根瘤菌的筛选　138　
三、耐苦参碱荧光标记根瘤菌回接对植株生长的影响　141　
四、耐苦参碱根瘤菌剂制备及其利用　147　
第五章　苜蓿与根瘤菌高效共生匹配性选择机制　153　
第一节　苜蓿品种与根瘤菌株结瘤效应及亲属性关系　153　
一、苜蓿品种随机接种根瘤菌群体结瘤效应特征　153　
二、苜蓿品种与根瘤菌株的亲属性关系　164　
第二节　苜蓿根瘤菌生物型划分及专一性结瘤共生机制　165　
一、苜蓿根瘤菌表型特征研究　165　
二、苜蓿根瘤菌生物型划分　171　
三、专一性结瘤共生机制研究　172　
第六章　苜蓿内生根瘤菌共生体构建　198　
第一节　自然条件下根瘤菌在苜蓿植株中的内生途径　198　
一、根瘤菌在苜蓿植株体内的分布动态　198　
二、根瘤菌在荚果内的分布及运移动态　201　
第二节　荧光蛋白标记根瘤菌在苜蓿体内的运移和定植　205　
一、荧光标记根瘤菌构建　205　
二、荧光标记根瘤菌对苜蓿芽苗的侵染及体内运移　213　
三、荧光标记根瘤菌对室内苜蓿幼苗的侵染、运移、定植影响因素　218　
四、荧光标记根瘤菌对田间植株的侵染、运移、定植及影响　231　
五、外源物质对标记根瘤菌在苜蓿体内运移和定植的调控　241　
第七章　种子内生根瘤菌代际续传与共生效应稳定性　301　
第一节　内生根瘤菌苜蓿种子贮藏后的变化特征　301　
一、不同产地的种子内生根瘤菌变化特征　301　
二、不同贮藏年限的种子内生根瘤菌变化特征　301　
三、不同贮藏温度的种子内生根瘤菌变化特征　307　
四、贮藏方法对不同接种处理的种子内生根瘤菌定植的影响　308　
五、外源物质对苜蓿种子内生根瘤菌代际传递定植的调控　310　
第二节　内生根瘤菌苜蓿种子共生效应代际传递　312　
一、苜蓿内生根瘤菌种子在次代植株营养生长期的传代结瘤能力　312