第1章绪论
1.1精准医学的定义
美国政府于2015年1月宣布，将投人2.15亿美元支持“精准医疗计划”，促进精准医学的发展，将其应用于患者医疗服务。在生命科学领域，“精准医疗”和“个性化医疗”这两个概念很相似，有时可以互相替换。但是，“精准医疗”更流行，它更强调通过分子水平信息将疾病和患者进行分类，而“个性化医疗”则更强调根据每个人的特特征来制定治疗和预防策略。美国政府的资金支持极大地推动了精准医学的发展[1，2]。
实现精准医疗需要建立可靠的数据资源，包括基因组、暴露组、病史、社会因素和生活方式因素等。这些因素是相互作用的，需要协同分析来为每位患者提供个性化、精准的医疗方案，从而提高药物的有效性和安全性，降低常见复杂疾病的易感性[3，4]。精准医疗不是孤立的，而是一个高度互动的领域，涉及医学、生物化学、分子生物学、遗传学、社会学、政治学、信息学和生物统计学等多个学科。2003年，人类基因组计划（HGP）的完成开启了后基因组时代。随着分子医学特别是遗传学、信息学等高新技术的快速发展，我们对DNA的精确分子结构和基因组结构有了更深人的理解，这改变了我们对健康的看法。高通量技术（如纳米技术、蛋白质组学、代谢组学）使科学家和医生对如何精确检测和最终治疗疾病有了更多的思考[5]。通过个体遗传信息或基因组学信息来预测个体未来的健康变得可行。如今，我们已经可以在疾病前期或药物治疗开始之前建立预防性和定制化的检测和干预方案。
不同的环境和生活方式，基因会以不同的形式存在，导致了基因的多样性和遗传差异[6，7]。进人后基因组时代，我们可以使用遗传信息或基因组学信息来预测个人未来的健康状况。我们的基因存在“多态性”，即不同的基因位点有不同的形式，例如单核苷酸多态性（SNP）。SNP检测可以帮助我们更好地了解各种情况下的代谢特性[8]。作为新遗传学的一部分[9]，精准医学可以利用多态现象来指导常规医疗实践。根据基因组学研究成果，将分子和遗传学分析与临床病理数据匹配对于判断疾病的风险（“谁容易得病”）、诊断疾病的原因（“是什么引起的病”）、预测疾病的发展（“谁需要及时治疗”）和选择合适的治疗方法（“怎样才能治好”）非常重要，甚至可以作为日常个性化健康保健中治疗决策和预防策略的一部分[1。，11]。但是，酶的活性不仅受遗传因素的控制，还受环境因素的影响，这些因素可以改变基因活性和基因表达，导致不同疾病的表现形式有所不同。细胞和组织在不同交互层之间保持连续通信，如DNA、RNA和蛋白质，以维持机体稳态并调节对外部环境刺激的生物过程。图1-1显示了预测性医学和个性化/精准医学的主要原则，个人作为“开放系统”的结果，是基因和环境（如生物、心理、电磁波等因素）不断相互交流的结果，而这些因素在疾病的相互作用和发展过程中起着重要作用[12]。此外，生物统计学和生物信息学方法在预测每个特定案例中疾病的相对风险方面起着关键作用。我们无法改变基因结构，但我们可以通过生活方式和基因表达的反馈原则来影响基因表达结果，例如通过表观遗传调控转录（疾病的发生或预防、药物代谢），以预防或延迟疾病的发生[13]。
“精准医学”的应用将在大多数医学领域中逐步扩大，特别是在目前我们所观察到的与环境相关的复杂多因素非传染性疾病中，如癌症、心血管疾病和糖尿病等[2]。“精准医疗”的基本理念之一是确定不同疾病的遗传风险因素信息，以告知患者并主动改变其生活方式。因此，通过更好地了解个体的遗传信息，可以预防由环境引起的疾病（如大多数癌症、糖尿病、高血压、心血管疾病等多因素疾病），并研究应用药物遗传学方面的知识，对继发性药物反应进行干预。例如，糖尿病“基因风险评分”高但尚未罹患糖尿病的人群可能会被建议改变生活方式，如减肥和积极锻炼。因此，精准医学旨在开发有针对性的医疗和干预措施，每个人都应根据其自身的情况进行分析和检查，包括环境、遗传、生活方式，甚至社会经济和家庭互动，因为所有这些在日常实践中使用的信息都有助于形成个人健康记录[14]。了解遗传变异与人类疾病相关的基因-环境相互作用是精准医学面临的重要挑战。通过药物基因组学的帮助，精准医学可以将功能基因组学转化为合理的治疗方法，确保患者在正确的时间以正确的剂量获得正确的药物[15，16]。在个性化干预新时代，将药物基因组学知识转化为临床实践，根据个人特的基因来优化药物和药物组合，是实施个性化医疗的首要任务，是“精准医学”的重要组成部分[16，17]。由于基因数据的指数级增长及环境因素信息正在成为医疗服务中的重要工具，为了使精准医疗在临床水平上发挥作用，实施存储全面、针对个人数据的电子健康记录（EHR）至关重要[18]。此外，精准医学还依赖于准确识别和将相关亚组患者分类的能力，以及从广泛的临床和基因组数据集中获取有效信息的能力。临床决策支持系统可以提供将不同临床表型数据与基因组数据相结合的机会，从而在临床层面生成更多可操作的信息（图1-2）。
根据2010年Ropers和2012年Kuehn的研究，大约有4000种疾病是由单个基因的缺陷导致的单基因遗传病[19，2。]。所有的基因，包括那些导致单基因病的基因，都有可能与复杂疾病有关。复杂疾病是指涉及多个基因，并且与环境因素相互作用的疾病。大多数孟德尔遗传病涉及基因编码序列内部的结构变化（如SNP、缺失、拷贝数变异），直接导致基因功能缺陷。在糖尿病患者中，大多数单基因缺陷是由参与胰岛素分泌、葡萄糖转运等功能的基因序列缺陷引起的。例如，肝核因子4a(hepatic nuclear factor 4 alpha，HNF4a）
基因的多态性已被确认为导致糖尿病的一个风险因素。该基因编码的转录因子在调节胰腺P细胞中的基因转录方面发挥着重要作用。HNF4a基因的多态性可能导致HNF4a蛋白质结构和功能发生变化，进而影响胰岛素分泌和葡萄糖代谢，最终导致糖尿病的发生[21]。相反，在多基因病中，大部分单核苷酸多态性位于编码序列之外，例如位于3'和5'片段、内含子中或完全位于基因之外，通常参与基因转录的控制。一个复杂的例子是尿调制蛋白(uromodulin，UMOD）基因，它在多基因病中的作用能够很好地通过大量的编码序列外的多态性来说明，这些多态性与糖尿病肾病有关[22]，而基因编码序列内的突变导致一种常染色体显性的肾病，即一种与糖尿病无关的单基因病——家族性间质性肾病。
自宏基因组学问世以来，最近的研究表明，代谢性疾病与肠道菌群之间的联系可能至关重要（图1-3）。肠道菌群的组成可被认为是调节宿主新陈代谢的环境因素，肠道菌群包括超过400个物种，超过100万亿个细胞（大约是人体细胞总数的10倍）[26]。肠道菌群的调节和扰动似乎与肥胖和2型糖尿病（T2D）等机体代谢紊乱密切相关[27—31]。因此，调节肠道菌群可能是治疗肥胖或糖尿病患者能量平衡的重要策略[31，32]。此外，同样重要的是要注意人类微生物组包含的基因数量是人类基因组的150倍[33]。有证据表明，短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）丁酸盐可以改善2型糖尿病的代谢控制[31，34-36]。肠道微生物群的不同组成会导致产生不同的SCFA，而丁酸盐是结肠发酵SCFA的终产物之一，可调节多种细胞过程如细胞分化和抑制不同细胞系的肿瘤细胞增殖[37，]。丁酸盐也能了解肠道微生物生态系统的组成和肠道微生物标志物如SCFA的比例，是未来精准医学的关键要素。但是，我们仍然需要更多的研究来支撑更精确的诊断、治疗干预，并最终通过干预生活方式来预防和控制疾病[28，35]。饮食调节是干预生活方式的一种选择，例如增加高膳食纤维食物摄人量，膳食纤维是影响肠道微生物群组成的短链脂肪酸的重要来源。增加丁酸盐浓度与降低胰岛素抵抗以对抗代谢综合征和糖尿病，也可能是预防与治疗肥胖症和2型糖尿病的重要途径[35，36，44，47-5。]。另外需要考虑的是由于存在个体差异，应该同时纳人肠道微生物群和生活方式因素的个性化水平评估，以确定其是否会诱发2型糖尿病的发展。在这个后基因组时代，科学家对快速发展的“组学”（转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观基因组学、微生物组学）寄予了厚望，希望通过这些方法能够更好地理解多基因多因素慢性复杂疾病的分子基础，并最终能提供更精准的方法来有效治疗疾病[51，52]。精准医学需要从大量的临床和基因组数据集中准确识别相关疾病亚群患者，通过“定制”的方法来检测、预防和治疗疾病[53]。
生命科学领域越来越关注临床疾病背后的分子特征，重点强调“预测/预防”未来的健康结果，预测疾病易感性，并减少不确定的治疗决策[53]。更好地了解遗传信息可以让我们控制由环境诱发的多因素疾病（如糖尿病、高血压、心血管疾病、癌症）的发展，当然也可以通过药物遗传学预防继发性药物反应，对于减少过度的医疗花费也很重要。结合对肥胖和2型糖尿病的表观遗传基因调控产生影响，即肥胖和2型糖尿病中肠道微生物群的不同组成可能影响基因的表观遗传调控。例如，编码SCFA受体FFAR2和FFAR3的基因通过组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的抑制和超乙酰化引起FFAR基因表达和信号通路的变化。影响代谢性疾病的发生和FFAR家族的表观遗传学调控可能是2型糖尿病的潜在治疗靶点之一。
大数据采集和电子健康记录（electronic health record，EHR）的应用，加上患者的参与，新的医学时代即将到来。广泛采用电子健康记录能更好地进行患者分类，同时也将增进我们对复杂疾病表型的理解。基因组技术的经济评估对于卫生经济学家来说是一个重要的挑战，因此我们可以汇集不同卫生部门和多学科的海量数据进行分析，作为相关政策制定的数据支撑。另一个关键点是临床医生的教育，尽管临床医生希望实践精准医疗，但他们并不熟悉如何实现精准医疗，也不能将其转化为临床应用。因此，为了将精准医学快速整合到临床医疗实践，需要对临床医生，特别是基层医疗机构医生[63]进行最新的基因组学知识和技术方面的培训[64]。在药物遗传学测试应用方面，还需要考虑市场上商业药物测试的可用性和合格程度问题。
在后基因组时代，关于如何改善健康状况与环境状况的争论一直持续存在[67]。这需要在社会实践中不断发现问题、解决问题并最终总结有效可行的解决方案[67]。建立健康和可持续发展的现代化社会需要科学和其他各个学科组成的“综合知识生态系统”。健康对于个人和社会都至关重要，这也是一项基本人权，精准医学同样如此。精准医疗已成为健康的基石，然而许多中低收人国家仍然缺乏全球公共卫生基因组学数据，因此需要开展区域科学研究能力建设。社会需要精准医学，因为它符合不同收人水平国家的社会、伦理、技术和疾病负担的现实。
1.2NGS技术与临床病原微生物诊断
现代医学在诊断和治疗感染性疾病时需要一个准确的检测方法，而传统的培养方法被认为是最可靠的病原体检测方式。然而，传统的培养方法存在许多局限性，如运输问题、培养基选择问题等，这些因素可能会导致检测结果不准确。将NGS技术应用于感染性疾病的检测能够很好地解决这些问题，该技术能够快速准确地检测到细菌和真菌。这种技术基于DNA测序，可以在病人的样本中检测到微生物的DNA，即使这些微生物难以培养或者不能够被传统的培养方法检测到（图1-4）。研究表明，NGS技术能够检测到那些在传统培养方法中未被发现的微生物，如产单核李斯特菌、猪链球菌、军团菌和肺孢子菌等。NGS技术的应用可以提高感染病例的检测率，帮助医生更快地做出诊断，提高治疗效果，减少患者的痛苦和降低疾病传播的风险。
为了更好地应用NGS技术，需要考虑其成本效益和技术局限性。对于轻度及传统检测方法能够明确诊断的感染，如尿路感染和皮肤软组织感染等，不建议使用NGS检测，因为传统检验方法已经足够。对于人源性细胞或背景菌较多的感染标本，如粪便标本，也不建议使用NGS检测，因为可能会影响检测结果的准确性。然而，在某些情况下，NGS技术是非常

目录
第1章 绪论1
1.1 精准医学的定义1
1.2 NGS技术与临床病原微生物诊断 5
第2章 分子诊断和大数据技术在精准医学中的应用 15
2.1 引言 15
2.2 表型分型方法在精准医学中的应用 16
2.3 高通量测序技术在精准医学中的应用 20
2.4 纳米医学技术在精准医学中的应用 21
2.5 大数据技术在精准医学中的应用 23
2.6 精准医学的政策和伦理问题 26
2.7 总结 26
第3章 微生物群与临床传染病学 31
3.1 引言 31
3.2 微生物群概述 32
3.3 微生物群的决定因素 33
3.4 微生物群在调节传染性疾病中的作用 34
3.5 基于微生物群移植治疗艰难梭菌感染 35
3.6 微生物群与 HIV感染的关系 37
3.7 微生物群对疫苗免疫原性的影响 37
3.8 微生物组治疗的未来前景：以粪菌移植为例 38
3.9 总结 40
第4章 NGS技术及其在临床医学领域的应用与挑战 44
4.1 引言 44
4.2 NGS平台及其技术路线的发展 45
4.3 NGS数据分析 48
4.4 参考数据库 53
4.5 NGS技术在临床医学中的应用 54
4.6 总结 57
第5章 病原微生物 NGS技术原理 64
5.1 引言 64
5.2 宏基因组分析 65
5.3 基于组装法的宏基因组分析 67
5.4 基于分箱的宏基因组分析 69
5.5 基于映射的宏基因组分析 72
5.6 标记法宏基因组分析 73
5.7 案例分析 76
5.8 总结 77
第6章 病原微生物 NGS大数据处理 81
6.1 引言 81
6.2 硬件和基础设施 82
6.3 软件资源 84
6.4 生物数据库 90
6.5 大数据处理的计算挑战 96
6.6 大数据在医疗中的伦理和法律挑战 99
6.7 总结 101
第7章 NGS技术在临床微生物学中的应用与优势 106
7.1 引言 106
7.2 全基因组测序在临床微生物学实验室中的应用 107
7.3 全基因组测序在病原体鉴定中的应用及优势 108
7.4 全基因组测序在疫情调查和监测中的应用110
7.5 宏基因组测序技术在临床病原体检测中的应用 111
7.6 无偏倚宏基因组学高通量测序法和靶向宏基因组学高通量测序法112
7.7 临床微生物学新一代测序工作流程及其优势113
7.8 总结114
第8章 临床病原微生物宏基因组项目流程搭建与案例分析 118
8.1 引言118
8.2 宏基因组学在临床微生物群落分析中的应用119
8.3 样本处理与宏基因组样本的制备方法 122
8.4 文库制备与质量控制策略 122
8.5 如何选择合适的测序平台 123
8.6 去宿主和病原体富集策略 123
8.7 数据分析和结果报告 124
8.8 宏基因组学测序中的质控指标 127
8.9 临床实用性129
8.10 临床案例分析 130
8.11 总结 134
第9章 NGS技术在微生物其他领域中的应用 141
9.1 引言 141
9.2 基于 NGS的微生物定量分析 142
9.3 NGS揭示细菌群体的遗传异质性 145
9.4 宏基因组揭示微生物群落生态系统的复杂性 146
9.5 微生物群与宿主的共同进化 146
9.6 微生物在疾病治疗中的应用 148
9.7 微生物在食品和农业生产中的应用 149
9.8 人类活动对微生物群落的影响 149
9.9 基于NGS技术的微生物组研究与挑战 150
9.10 总结 151
第10章 微生物组研究的未来前景 157
10.1 引言 157
10.2 宏基因组学在农业和食品微生物学中的研究前景 158
10.3 宏基因组学在人类发育和疾病微生物中的研究展望 158
10.4 微生物组数据在临床应用中的隐私安全管理 160
10.5 微生物组研究的伦理道德问题 162
10.6 总结 163