第一章基因治疗概述
第一节 基因治疗的概念及类型
基因治疗是通过对基因进行修饰来治疗疾病的技术。针对一些难治性疾病（包括单基因遗传病和癌症等），基因治疗显示了非常显著的疗效。基因治疗是目前生物制药*前沿的领域之一，自2003年以来已经有多个基因治疗药物分别在中国、美国和欧洲等地获批上市（表1-1）。
近年来，基于细菌核酸酶的基因编辑技术高速发展，该法可以对基因进行精确的添加、切除和校正。Cas9是目前研究*深入的核酸酶。利用该酶进行基因编辑的原理是通过设计的指导RNA（gRNA）靶向细胞基因组特定位置的DNA，由CRISPR/Cas9诱导产生双链断裂（DSB），从而在修补过程中完成基因的添加、切除或校正（图1-1）。其中，非同源末端连接（NHEJ）介导的修复可引起DSB位点的DNA序列插入或缺失碱基导致基因失活；同源重组介导的同源定向修复（HDR）则在同源供体DNA模板的存在下，利用同源重组在特定位点添加新序列或纠正突变。*新的单碱基编辑技术利用基因工程改造的核酸酶，在细胞基因组上只产生单链切口从而实现对基因的编辑。该方法可通过增强基因编辑准确性和降低脱靶风险来提高治疗的安全性。
从治疗机制来看，基因治疗可以划分为基因替代（gene replacement）、基因沉默（gene silencing）和基因添加（gene addition）。基因替代通过导入正常基因来替代缺陷基因，从而发挥机体所需要的基因功能。基因沉默是通过基因敲除（gene knock-out）、表达反义RNA等方式终止功能异常的致病基因的活性。基因添加则是通过基因敲入（gene knock-in）等方式导入新的外源基因发挥治病功能。
基因治疗根据治疗途径可划分为体外和体内两种（图1-2）。体外基因治疗首先通过载体将治疗基因导入细胞，之后再将细胞输入患者进行治疗。嵌合抗原受体T细胞免疫治疗（CAR-T）就是其中一个经典例子。其原理在于先在体外将患者T细胞从血液中分离培养，之后再将靶向并杀死癌症细胞的基因利用慢病毒载体导入T细胞，*后将成功改造的T细胞大量扩增后输入患者体内杀死肿瘤细胞。体外治疗的另一个例子是体外利用携带正常功能基因的逆转录病毒感染造血干细胞，之后再将经过改造的造血干细胞移植到遗传病患者体内进行治疗。目前的适应证包括腺苷脱氨酶缺陷型重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID）、地中海贫血（thalassemia）或镰状细胞贫血（sickle cell anemia）等。体内基因治疗则是将携带治疗基因的载体直接输入患者体内进行治疗。这些载体可成功靶向目标细胞，表达治疗基因。典型的成功案例包括利用重组腺相关病毒（rAAV）对遗传病如先天性黑矇（LCA）和血友病B患者的治疗：前者是将携带正常RPE65基因的rAAV通过视网膜下注射实现视网膜上皮细胞的感染；后者是将携带正常凝血因子Ⅸ基因的rAAV通过静脉注射实现肝脏细胞的靶向感染。
第二节 基因载体的制备
基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体。常用的病毒载体有腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体等；非病毒载体有纳米颗粒、脂质体等。病毒载体感染效率和靶向性高、毒副作用低，是基因治疗中目前更常用的载体，但其质控难度大、成本高。非病毒载体具有容易制备、成本较低、容易质控、携带基因的大小受限制小的优点，缺点在于靶向性和感染效率较差。
现有的病毒载体中，rAAV载体在遗传病的基因治疗中*常用，慢病毒载体在癌症的CAR-T上常用。常见病毒载体的分类及相关特点如表1-2所示。
一、病毒载体的制备
目前病毒载体的常用制备方法主要有两种。一种是利用质粒共转染细胞制备病毒载体，如rAAV和慢病毒载体。另外一种是利用同源重组方式获得少量病毒载体后，再进行扩增制备大量需要的病毒载体，如腺病毒载体和痘病毒载体。
（一）质粒共转染
以rAAV载体为例，该载体通常是利用三质粒共转染293细胞或239T细胞来制备（图1-3）。三个质粒分别携带治疗基因（两端是AAV包装信号ITR：末端反向重复序列）、AAV包装辅助基因（Rep/Cap）和腺病毒辅助基因（E2A、E4orf6和VARNA）。病毒收获液经过纯化后用于体内基因治疗。
慢病毒载体通常也是利用三质粒或四质粒共转染制备，一般采用293T细胞。质粒分别携带治疗基因（两端是慢病毒包装信号LTR：长末端重复序列）、整合酶、逆转录酶和其他包装辅助基因。病毒收获液经过纯化后用于体外细胞感染。
病毒载体利用多质粒的原因之一是希望尽量减少非同源重组产生的类似野生型病毒的能复制的病毒载体（replication-competent virus），这类载体会影响病毒类基因药物的安全性。
（二）同源重组
重组腺病毒载体是将治疗基因放在穿梭质粒上，在细菌内利用基因重组获得需要的携带重组腺病毒基因组的质粒，然后再将该质粒通过转染293细胞获得重组病毒。这样获得的重组病毒经过扩增和纯化后用于基因治疗（图1-4）。
重组痘病毒载体是将治疗基因放在带有两个痘病毒同源序列之间的质粒上，在质粒转染及改造的缺陷型痘病毒感染细胞后，利用质粒上的两个痘病毒同源序列在细胞内和缺陷型痘病毒进行基因重组，通过筛选获得需要的重组痘病毒。*后该重组痘病毒经过扩增和纯化后用于基因治疗。
二、非病毒载体的制备
非病毒载体中，脂质体载体的应用早，相关研究全面。随着纳米技术的发展，不同材料来源的纳米载体正成为新兴的非病毒
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