第1章AIE概述
一、荧光在生物成像中的重要性
光是一种重要的自然现象，人类诞生伊始，便通过光感知世界万物。随着人类文明的发展，光成为人类生产和生活中不可或缺的因素。光不仅能够作为能量的载体，为人类提供资源，同时还能作为信息的载体，帮助人类观察客观世界斑驳陆离和瞬息万变的景象，进而增进对世界的了解。随着人类文明的不断推进，光成为科学研究的工具，人类在认识世界的同时发现了许多自然界的规律。中国古代*早对光的研究可以追溯到春秋战国时期，墨子及其弟子在《墨经》中对小孔成像实验进行了记载。人们对光和像的认识加速了光学元件和仪器的出现和发展。15世纪末至16世纪，凹面镜、凸面镜、眼镜、透镜等光学元件相继出现，使得人类对客观和微观世界有了进一步的观察和研究。17世纪初，延森（Janssen）和冯特纳（Fontana）发明了**架显微镜。但由于光学显微成像系统存在的物理限制、成像条件不佳和人为干扰因素，导致出现模糊等降低成像质量的问题。因此，提高成像质量（例如对比度和分辨率等）对获得更精准和全面的结构信息以及深入了解复杂的生物组织和生物学机制具有重要的意义。近年来，生物成像除了上述的显微成像技术之外，还包含了荧光成像、磁共振成像（MRI）、超声成像、光声成像、正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）等。值得注意的是，荧光成像技术是一种直接可视化技术，可作为生物成像领域理想的应用工具。
荧光的*早发现可以追溯到1845 年，Sir John Frederick William Herschel*次发现奎宁在450 nm处发射蓝色荧光。自此，其他一些荧光材料（如叶绿素、香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY等）被陆续发现和开发。基于荧光材料的荧光成像技术具有实时成像、可视化程度高、对生物样品损伤小、通用性强等优势，因此成为研究细胞机制和可视化各种生物过程不可或缺的方法。并且，这种荧光成像技术相比于其他成像技术，在活细胞和离体组织切片方面展现出更高的灵敏性、高分辨率和高对比度。荧光成像技术是利用荧光团受到激发后发射出荧光信号，通过观察和整合荧光信号的产生和猝灭，实现信息的感知和可视化。
目前，基于荧光的成像技术作为生物成像技术的一个重要分支，相关研究工作者们已经设计和合成了多种结构的荧光材料，以满足日益增长的成像需求（如生物大分子标记、亚细胞成像、细胞成像、细菌成像、活体成像等）。荧光成像技术的深入进展依赖于先进的荧光材料的发展，而荧光材料的亮度、光稳定性、对比度、生物相容性等直接影响着荧光成像质量。合理的分子结构设计可以有效地提高荧光材料的发光效率。良好的光稳定性使得荧光材料可以随着辐照时间的推移保持稳定的荧光信号，而较差的光稳定性则会导致荧光材料在光辐照下快速发生光漂白。此外，用于生物成像方面的荧光材料还需要遵循生物相容性、低细胞毒性和良好细胞通透性的要求，这样才能获得理想的成像结果。同时，还需要考虑荧光材料与目标物体与背景噪声之间是否能够提供足够的对比度。这里的对比度是指荧光材料发射的荧光信号与周围黑暗背景产生显著差异的现象。*小化背景信号对于获得高分辨率图像至关重要。波长在400 ～ 650 nm的可见光区间是**的荧光成像范围。然而，光子与生物组织之间的相互作用（如光散射和自发荧光等）也会影响荧光信号的获取，导致较低的组织穿透性和成像分辨率，进而使得生物体的生理和病理信息缺失。生物组织中的光子散射会随着波长的增加而减少，因此具有较长激发和发射波长的近红外荧光材料在组织穿透和信噪比方面表现出优异的活体成像性能。
荧光在分子层面上能够对分析对象进行无创、实时、特异性和灵敏的动态监测与分析，进而阐明和可视化生物体内部组织结构和生理功能信息，更好地帮助对疾病进行检测、定性、评估和诊疗。由此可见，荧光在生物成像研究领域中具有明朗的发展前景。
二、ACQ及AIE介绍
对有机荧光分子的研究可以追溯到很久之前。早在20 世纪中叶，F？rster 在研究分子发光时就发现：当发光分子处于分散状态时可以发射很强的荧光，而浓度增加后分子之间由于非辐射能量转移，发光强度会减弱甚至完全消失。这种现象在1970年被Birks描述为“在大部分芳烃及其衍生物中很常见”[1]。这种传统的有机荧光分子在高浓度或聚集状态下荧光强度降低甚至消失的现象，也被称为“聚集导致荧光猝灭”（aggregationcaused quenching，ACQ）现象。然而，在实际应用中，不可避免地会出现分子高浓度溶液或分子聚集态下的荧光应用，而ACQ效应的存在导致许多传感器和生物探针成像灵敏性能大大降低，对实际的生产应用造成了很大的影响。通过对ACQ结构的研究，人们意识到其聚集态下的荧光猝灭主要是由分子堆积引起的，因此，减少其聚集和堆积是一个很容易想到的提高荧光强度的策略。但这些策略使得分子的合成更加烦琐，也不能从源头上解决分子聚集带来的问题。
科学家们也想到了另一个“顺其自然”的解决方法。由于范德华力等分子间相互作用，分子在微观下的聚集是一个自发的过程，如果可以找到一类荧光分子，让其荧光效率随着自己的聚集而逐渐增强，许多问题就能够迎刃而解了。香港科技大学的唐本忠课题组团队经过发现和取证，于2001年报道了多取代硅杂环戊二烯（噻咯）的发光性质[2]。这种分子在稀溶液中几乎不发光，但是随着不良溶剂（水）的不断加入，分子聚集发光显著增强（图1-1），“聚集诱导发光”（aggregation-induced emission，AIE）这一概念*次被提出。具有AIE效应的分子相比于传统的荧光分子表现出了截然不同的光物理性质，对其结构的观察和机制的探究，使得人们对于有机荧光有了进一步的认知，这也为生物荧光成像带来了全新的机遇。
三、AIE机制
聚集诱导发光作为一个光物理化学现象，拓宽了人类对于发光现象的认知，也为人工发光的设计提供了更多的思路。理解聚集诱导发光现象的产生机制有助于更好地理解荧光分子的光物理过程，这对于小分子荧光染料的设计开发、实际应用转化、促进科技创新等领域都具有重要的指导意义。同时，聚集诱导发光的研究对象涉及光电分子从单分子态到溶液态、固体态等聚集态的光物理性质变化。对其发光机制的研究，可以帮助更加深入地理解聚集体科学，研究分子性质随着聚集的变化规律。自聚集诱导发光概念于2001年问世以来，研究者们一直渴望对这一现象背后的内在机制作出合理的解释。在20余年的研究中，人们对其机制作出了多种模型构建，其中被普遍接受的机制解释为分子内运动限制（RIM）理论，本节将对此理论的主要内容、典型分子、量子力学解释与优化等方面进行阐述。
1. RIM理论的主要内容 在AIE现象发现之初，研究者们就通过对一系列具有AIE效应的荧光体（aggregation-induced emission luminogens，AIEgens）的结构进行研究后，总结出了这类分子在结构上的共性。他们探讨了其中分子的平面性和旋转自由度、分子内结构限制、分子间相互作用、分子E/Z异构等因素对于其发光性质的影响。此后大量的研究总结都表明，对于大多数AIEgens而言，它们都显示出高度扭*的螺旋桨状结构。这意味着，其中的扭*结构或在AIE现象中起着关键作用。基于观察与这一合理性假设，唐本忠团队提出了*为**的分子内运动受限（restriction of intramolecularmotions，RIM）模型来解释这一分子结构导致的聚集态现象（图1-2）。
基础物理学表明，任何运动，无论是微观的还是宏观的，都需要消耗能量。分子的运动包括旋转和振动，根据这一特点，RIM又细分为分子内旋转受限（restriction of intramolecular rotations，RIR）和分子内振动受限（restriction of intramolecular vibrations，RIV）。许多AIE发光团在溶液状态下具有良好的旋转活性或是振动活性，这导致受激发的分子能量主要通过非辐射衰变的方式弛豫回到基态，荧光量子效率低，表现为弱荧光或无荧光；而在聚集态下，由于物理约束，分子内转动受到限制，非辐射通道被阻断，辐射通道被打开，荧光量子效率增强，表现为聚集态下的荧光强度增加。值得注意的是，ACQ和AIE都是对分子发光现象的描述，因此当在阐述AIEgens结构特征时，从逻辑上讲是一种概括性归纳，仍然需要通过进一步的实验设计来证明这一假设的普适性。
图1-1 噻咯在不同含水比例的四氢呋喃/ 水混合溶液中发光强度
2. RIM理论的拓展解释 从历史上看，科学家们通常认为物质的性质是由分子的性质决定的。上述对于RIM机制的解释，是在早期对发光材料的研究中，基于稀溶液中的孤立分子体系假设提出的。然而，在现实中，随着分子从单体变为聚集态，新的特性也可能会逐渐显现。例如，亲水性氨基酸经过自组装可以形成具有空间结构的疏水性蛋白质。值得注意的是，一些在单分子或稀溶液下不发光的非共轭分子（如糖）在聚集或团聚时往往会表现出发光现象。这主要是因为分子中含有的富电子原子或基团的电子云重叠，这种簇聚发光比单*的原子或基团有更高的电子共轭，形成簇聚发光现象。在某些系统中，固体粉末下的AIEgens只能轻微团聚，分子内运动仍然有很大的自由度，仍然会导致非辐射途径的能量耗散，而形成AIEgen晶体后，规整的晶体结构将分子运动进一步限制，发光得到增强。这种现象在磷光材料中更常见，因为它们的三重态比单重态更容易发生非辐射衰变。这意味着，对RIM机制的利用不仅仅涉及分子工程上的调控，也可以通过介观维度抑制分子运动，来实现聚集态下的荧光增强效果。近些年来，唐本忠团队从分子失活途径角度入手，并借助量子化学的研究方法，进一步将RIM机制拆分成四个限制途径[3]。
*先，对于具有活跃分子运动的AIE系统，其激发态能级与基态能级间电子振动耦合引起的内转换通常非常快，超过荧光速度，导致稀溶液环境下的荧光猝灭。例如，AIEgen在激发时经历苯环扭转和双键扭*（图1-3A），这使得S1和S0之间存在强烈的电子振动相互作用，S1态的势能面非常平坦，并且涉及许多具有高量子数的振动态。这些振动态与S0态的振动态重叠得很好，并急剧加速了内部转换的速率。相反，在固体中，扭*运动受到空间约束和周围分子相互作用的阻碍，需要更高的能量，这导致了一个陡峭的势能面（PES）。此时，S1 和S0中的振动模式较少，并且它们的波函数重叠不太有效。受S1-S0电子振动耦合（RVC）的限制，AIEgens在聚集态下发射增强。
其次，还有许多AIE分子，如图1-3B中所示的AIE分子，在激发态下分子构型发生了较大变化，使得激发态和基态出现上述的圆锥形能量交叉点。由于此时S1 和S0是简并的，振动相互作用的幅度接近无穷大，导致非辐射衰减。然而在聚集状态下，这种构型的变化受到空间限制，从而通过限制进入锥形交叉口的方式减少了非辐射耗散，表现为荧光增强（RACI）。
此外，还应当考虑多重态和跃迁的选律问题，跃迁轨道的空间重叠性，跃迁前后的电子云对称性，π/n电子跃迁模式等因素都影响着实际跃迁概率。某些激发态具有较小的摩尔吸光系数和振子强度，导致较小的跃迁概率，产生禁阻。这些激发态有利于非辐射衰变，因此被定义为暗态。它们在溶液状态下的弱荧光分别归因于光诱导电子转移（PET）、扭*分子内电荷转移（TICT）和系间窜越（ISC）。实际上，这些量子物理过程可以统一归结为跃迁禁阻导致的猝灭效应。电子的转移或多重态变化会导致禁阻跃迁的形成，从而猝灭荧光（图1-3C）。而在聚集态下，导致分子进入暗态的分子运动受到限制，或暗态的能量升高，使其在热力学上不可到达。这样暗态得以被限制，分子发光恢复（RADS）。
除了光物理衰变途径之外，激发态的AIEgens还可能发生光化学反应，如光异构化和光环化（图1-3D），而这种变化往往伴随着
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