《microRNA调控水稻耐冷性的分子机制初探》针对影响寒地水稻生产的低温冷害问题，围绕水稻冷胁迫应答miRNA挖掘、耐冷功能验证、作用机制解析及育种利用等方面开展研究讨论。《microRNA调控水稻耐冷性的分子机制初探》以水稻测序品种‘日本晴’为试材，构建了水稻冷胁迫miRNA表达谱及miRNA-mRNA调控网络，鉴定出多个冷胁迫应答的miRNA，初步揭示部分miRNA调控耐冷性的作用机制，并通过转基因及基因编辑等技术，创制了多份耐冷性显著增强的水稻材料，为耐冷水稻育种提供理论指导与生物资源。

第1章概述
　　党的十八大以来，以习近平同志为核心的党中央始终把粮食安全作为治国理政的头等大事。2022年，中央一号文件更是将保障国家粮食安全作为底线任务。随着人类工业化不断发展，全球低温、干旱等极端天气频发，粮食生产环境恶化，给全球农业生产带来巨大挑战。我国作为农业大国，更需加强对极端气候的防范，保障国家粮食安全。
　　水稻(Oryza sativaL.）起源于热带和亚热带地区，是一种对温度敏感的作物。水稻整个生育期都有可能遭受低温冷害的影响，进而导致水稻减产。东北稻作区是我国*重要的水稻主产区之一，其水稻产量占我国北方稻区产量的70%。同时，该地区是我国纬度*高的水稻产区，全年平均气温不到10°C，延迟型和障碍型冷害频繁发生，对水稻的产量和品质造成了严重影响。因此，提高水稻耐冷性，对保障东北地区寒地水稻高产稳产，具有十分重要的现实意义。
　　培育耐冷水稻新品种是提高水稻耐冷性的有效手段。然而，水稻作为喜温作物，耐冷种质资源严重匮乏，依靠常规育种手段难以培育出耐冷水稻新品种。近年来，随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，转基因育种等现代分子生物学技术己广泛应用于作物育种，成为快速、高效培育特定性状作物新品种的重要手段。挖掘水稻耐冷关键基因，深入了解水稻响应低温冷害的分子机制，能够为耐冷水稻培育提供理论指导。
　　1.1水稻冷胁迫应答机制及转基因育种研究现状1.1.1低温冷害对水稻生产的影响
　　东北平原由于其农业生产条件优越，水土资源配置良好，夏季雨热同期，成为我国重要的水稻产区。但其位于我国温带季风区的*北端，温度成为限制该区域水稻生产的重要环境因素。尤其是黑龙江省，作为我国纬度*高的水稻产区，热量条件欠佳，经常遭受低温冷害侵袭。
　　1.水稻低温冷害类型
　　水稻冷害主要有延迟型冷害、障碍型冷害以及由这两种冷害相结合的混合型冷害3种类型。
　　延迟型冷害发生在水稻营养生长阶段，导致植株生理活动减弱，具体表现为水稻生长发育延迟，穗分化较晚，从而导致灌浆成熟期推迟，水稻成熟度下降，*终引发水稻减产。遭受严重延迟型冷害的水稻可能会颗粒无收；遭受轻微延迟型冷害水稻穗顶端颖花可正常开花、受精、结实，但穗中下部颖花产生结实障碍，出现大量瘪粒。
　　障碍型冷害出现在水稻生殖生长阶段，会破坏水稻花器官生理机能。幼穗形成期、减数分裂期、抽穗开花期容易遭受障碍型冷害，尤其是减数分裂期小孢子的发生对低温特别敏感，当气温低于17°C，就会出现花粉败育造成空壳。孕穗期临界温度为18C，气温每降低1C，结实率下降6.27%(陈可心，2015）。抽穗开花期遇到低温会造成花粉花药发育异常，同时减缓籽粒干物质灌浆速度，从而使产量降低。
　　混合型冷害是指在水稻整个发育过程中，延迟型冷害和障碍型冷害同时出现。混合型冷害对水稻生产造成的危害比单一冷害更严重，并且发生次数比单一型冷害更频繁。黑龙江冷害类型多为以延迟型冷害为主的混合型冷害。
　　2.低温冷害对水稻生理的影响
　　低温会通过影响光合作用的暗反应过程，抑制水稻光合速率。轻度低温会抑制叶绿素合成进程中一系列酶的活性，致使叶绿素生成速率下降；同时，轻度低温还会诱导叶绿素酶及其同工酶活性，加快叶绿素的降解。严重低温则会直接破坏叶绿体的膜结构，导致叶绿体解体（Wang et al.，2015a；Maruyama et al.，1990）。所以，遭受低温的水稻会出现叶片发黄、光合速率下降等现象。
　　此外，低温会对呼吸作用相关酶的活性产生影响，进而削弱呼吸作用，使能量产生减少。不仅如此，低温还会降低植物根系对营养物质的吸收能力，以及营养物质在植物体内的转运速率。
　　1.1.2植物冷胁迫应答机制研究现状
　　地球仅有1/3的陆地不会经历结冰期，超过40%的陆地会经历-20C的低温(Ramankutty et al.，2008）。植物作为固生生物，无法通过空间移动躲避环境因子变化带来的胁迫。在漫长的生物进化过程中，它们通过自然选择，在生理、形态、行为等多个方面表现出对环境的适应性。例如，一年生植物会在严寒来临前完成结实，结束生命周期；多年生植物会在冬季休眠以抵御严寒。生长在极端低温环境中的植物，体内糖类、脂类等物质含量较高，这能有效降低细胞液冰点，抵御严寒；同时，其形态多矮小呈莲状或垫状，并进化出有蜡质或被毛保护的叶片(Eremina et al.，2016;Guo et al.，2018）。热带与亚热带植物因生长环境优越，进化过程中难以形成冷适应机制，而较多温带植物则进化出了可抵御非致死低温的冷应答机制。在植物抵御冷胁迫的过程中，会通过复杂的基因调控网络，做出一系列生理生化变化，从而将低温对有机体的危害降至*低。因此，深入探究植物冷胁迫应答的基因调控机制，有助于研究人员更好地理解植物耐冷机制，也让通过基因工程方法提高植物耐冷性成为可能。
　　1.冷胁迫信号感知与第二信使
　　截至目前，尚未发现植物感受低温信号的直接证据和受体。现有研究表明，植物可通过改变膜的物理性质来感知低温信号，*明显的表现为，冷胁迫来临时，膜流动性降低（Orvar et al.，2000）。但事实上，在常温条件下，二甲基亚砜处理也能引起膜流动性降低，进而诱导冷应答基因（cold-responsive gene，COR基因）的表达；而用苄醇处理则会使膜流动性升高，抑制COR基因的表达（Orvar et al.，2000;Ding et al.，2015）。
　　冷胁迫会使细胞内Ca2+浓度增加，膜硬化处理也会导致胞内Ca2+浓度增加，进而激活蛋白激酶参与蛋白磷酸化信号传递过程，诱导COR基因表达(Zhu，2016;Mauger，2012）。细胞核内Ca2+信号对于控制基因转录具有重要作用（Mauger，2012;Manishankarand Kudla，2015），因此，对核膜和质膜转运体的研究，或许可以揭开Ca2+信号在植物冷应答过程中的具体作用。
　　植物具有多种Ca2+传感器，包括钙调蛋白（calmodulin，CaM）和类钙调蛋白(CaM-like，CML）、钙依赖性蛋白激酶（Ca2+-dependent protein kinase，CDPK）、Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，CCaMK）、CaM结合转录激活剂（CaM-binding transcription activator，CAMTA）、钙调蛋白B类蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）和CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK）。研究表明CDPK作为正调控因子发挥作用（Saijo et al.，2000），CaM3是耐冷性的负调控因子（Mickelbart et al.，2015）。CBL通过与CIPK家族蛋白相互作用来调控Ca2+信号。CBL1通过与CIPK7相互作用调节植物耐冷性，它的突变体cbll表现为冷敏感表型（Huang et al.，2011）。CAMTA3可以与启动子CG-1元件（vCGCGb）结合，正调控CBF2/DREB1C的表达，却不能调控启动子中没有该元件的CBF3/DREB1A表达，双突变体植株camta2/camta3表现为冰冻胁迫敏感（Jia et al.，2016）。
　　除了质膜，叶绿体在感受低温过程中也发挥着重要作用。当低温来临时，光系统II(photosystem II，PSII）对光能的收集利用平衡被打破，导致产生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。此外，蛋白磷酸化及蛋白磷酸酶活性的降低，也可能是植物感受低温的途径之一。MAPK(mitogen-activated protein kinase）级联信号途径也可能参与植物冷胁迫信号感知过程，并调节植物冷胁迫耐受性。低温来临时，拟南芥MKK2(MAPkinase kinase2）可磷酸化MAPK4和MAPK6，MKK2过表达可促进CBF/DREBI(C-repeat binding transcription factor/DREbinding protein）的表达，提高植物耐冷性(Teige et al.，2004;Zhao et al.，2017a）。
　　这些研究表明，植物感受到低温信号后，可通过多个不同的信号通路促进COR基因表达。
　　2. ICE-CBF/DREB1冷胁迫应答信号通路
　　ICE(inducer of CBF expression）是一类通过CBF/DREBI调控植物冷胁迫应答的转录因子，且在高等植物中功能高度保守。在植物冷胁迫应答的多个信号通路中，CBF/DREBI依赖的冷信号转导通路是*重要且研究*为明确的调节通路之一(Chinnusamy et al.，2007）。早在2004年，研究人员就从拟南芥中鉴定出3个CBF/DREBI它们参与植物COR基因表达和耐冷功能调节过程（Liu and Zhou，2017；Guo et al.，2017），CBF/DREB1转录因子（主要是CBF3/DREB1A）受ICE1调控（Hu et al.，2013）。
　　在拟南芥中，ICE1是一个冷胁迫正调因子，ICE1可以与CBF3/DREBIA启动子中的MYC顺式作用元件（CANNTG）结合（图1-1）(Hu et al.，2013）。ICE1作为调控CBF3/DREB1A和众多COR基因的主调控因子，调控了约40%的COR基因和46%的冷胁迫应答转录因子。玉米冷胁迫后，ZmDREBl启动子的ICE1结合区域出现组蛋白H3、H4高乙酰化和DNA去甲基化现象，并伴有染色质去凝缩现象，暗示了ICE1对CBF/DREB1的调控可能需要染色质重塑，同时ICE1受泛素化和磺酰化（图1-1）调节（Lee et al.，2005;Li et al.，2017;Miura et al.，2007b）。不过，ICE1的激活以及与第二信使之间的信号传递机制尚不明确。
　　CBF/DREB1可以与COR基因启动子中的CRT/DRE顺式元件（A/GCCGAC）结合，调节COR基因的表达，属于乙烯响应因子（ethylene-responsive element binding factor/APETALA2，ERF/AP2）转录因子家族（Licausi et al.，2013;Shi et al.，2018）。拟南芥中约12%的COR基因受CBF/DREB1调控，但3个CBF对COR基因的调控并没有明显靶标特异性（Park et al.，2015;Liu et al.，2018a）。拟南芥CBF2/DREB1C是一个抗冻负调因子，而CBF1/DREB1B和CBF3/DREB1A为正调控因子（Novillo et al.，2004），此外，CBFUDREBIB和CBF3/DREB1A并不参与CBF2/DREB1C的调节（Novillo et al.，2007）。这些结果表明拟南芥3个CBF/DREB1具有不同的功能，它们协同调控植物耐冷性，也体现出植物冷应答调控网络的复杂性。
　　3.转录后调控
　　转录后调控主要包括选择性剪接、mRNA前体加工、RNA核输出、RNA稳定性和RNA沉默调控。其中，mRNA前体加工和RNA核输出是真核生物基因表达调控的重要过程，在冷胁迫应答过程中发挥着关键作用（Han et al.，2011）。低温来临时，RNA分子构象会发生错误折叠，而RNA伴侶蛋白则帮助RNA恢复其天然构象；研究发现富含甘氨酸的GRP7(glycine-rich protein7）蛋白和RNA螺旋酶LOS4(low osmotic stress4）可帮助mRNA从细胞核向细胞质输出（Barrerogil and Sa

目录
“博士后文库”序言
前言
第1章 概述 1
1.1 水稻冷胁迫应答机制及转基因育种研究现状 1
1.1.1 低温冷害对水稻生产的影响 1
1.1.2 植物冷胁迫应答机制研究现状 2
1.1.3 水稻耐冷转基因育种研究 7
1.2 miRNA在植物非生物胁迫应答中的研究进展 8
1.2.1 miRNA的生物发生机制 8
1.2.2 miRNA的作用机制 11
1.2.3 miRNA参与植物非生物胁迫应答的研究进展 14
1.2.4 miRNA调控植物冷胁迫应答的研究进展 15
第2章 miR1320调控水稻耐冷性 17
2.1 水稻特异的miRNA——miR1320的来源 17
2.2 材料与方法 18
2.2.1 实验材料 18
2.2.2 实验方法 21
2.3 结果与分析 24
2.3.1 miR1320表达受冷胁迫抑制 24
2.3.2 miR1320正向调控水稻对冷胁迫的耐性 25
2.3.3 miR1320靶基因筛选及验证 32
2.4 讨论 45
2.4.1 miR1320在水稻冷胁迫应答中的作用 46
2.4.2 miR1320调控靶基因表达的作用机制探讨 47
2.4.3 miR1320调控的水稻冷胁迫应答信号通路 48
2.5 结论 49
第3章 miR1320-OsERF096调控水稻耐冷性 50
3.1 研究背景 50
3.1.1 AP2/ERF转录因子参与的信号转导途径 50
3.1.2 AP2/ERF转录因子植物逆境胁迫应答研究. 52
3.2 材料与方法 53
3.2.1 实验材料 53
3.2.2 实验方法 54
3.3 结果与分析 61
3.3.1 OsERF096负调水稻对冷胁迫的耐受性 61
3.3.2 OsERF096蛋白转录因子特性分析 70
3.3.3 OsERF096转基因水稻冷胁迫RNA-seq分析 80
3.3.4 OsERF096调控冷胁迫下ROS平衡、糖代谢和激素合成 86
3.3.5 OsERF096依赖JA调控的冷胁迫信号通路 103
3.4 讨论 109
3.4.1 OsERF096基因在水稻冷胁迫应答中的作用 109
3.4.2 膜结合转录因子OsERF096调控水稻耐冷性的分子机制探讨 109
3.4.3 OsERF096蛋白定位与结合元件的探讨 110
3.4.4 miR1320-OsERF096调控水稻耐冷机制的探讨 111
3.4.5 OsERF096抑制JA调控的冷胁迫信号通路的探讨 112
3.5 结论 113
第4章 miR1320-OsPHD17调控水稻耐冷性 115
4.1 研究背景 115
4.1.1 PHD家族转录因子的结构及功能研究现状 115
4.1.2 茉莉酸调控植物冷胁迫应答研究进展 119
4.2 材料与方法 123
4.2.1 实验材料 123
4.2.2 实验方法 124
4.3 结果与分析 128
4.3.1 OsPHD17转录因子特性研究 128
4.3.2 OsPHD17负调水稻对冷胁迫的耐受性 131
4.3.3 OsPHD17转基因水稻冷胁迫转录组测序及差异表达基因分析 143
4.3.4 miR1320-OsPHD1 调控冷胁迫下水稻体内ROS平衡 147
4.3.5 OsPHD17调控冷胁迫下水稻黄酮、木质素合成及糖代谢途径 154
4.3.6 OsPHD17通过JA介导的信号途径调控水稻耐冷性 160
4.4 讨论 171
4.4.1 OsPHD17基因在水稻冷胁迫应答中的作用 171
4.4.2 OsPHD17参与植物冷胁迫应答的分子机制 171
4.4.3 OsPHD17通过JA介导的信号途径调控水稻耐冷性 173
4.5 结论 174
第5章 水稻miR156k和miR1435耐冷功能分析 175
5.1 研究背景 175
5.1.1 研究的目的与意义 175
5.1.2 miR156和miR1435的研究进展 177
5.2 材料与方法 179
5.2.1 实验材料 179
5.2.2 实验方法 180
5.3 结果与分析 183
5.3.1 水稻miR156k的过表达 183
5.3.2 水稻miR156k耐冷功能分析 185
5.3.3 水稻miR156k耐冷分子机制研究 187
5.3.4 miR1435转基因水稻的获得 190
5.3.5 miR1435转基因植株农艺性状调查与耐冷性评价 192
5.3.6 miR1435靶基因预测与分析 195
5.4 讨论 198
5.4.1 miR156k 在冷胁迫应答反应过程中作用机制的探讨 198
5.4.2 miR1435功能及作用机制的探讨 198
5.5 结论 199
第6章 miR535调控水稻发育及耐冷性 201
6.1 miR535的研究进展 201
6.2 材料与方法 203
6.2.1 实验材料 203
6.2.2 实验方法 204
6.3 结果与分析 207
6.3.1 陆生植物miR535进化分析 207
6.3.2 OsmiR535组织表达特性分析 210
6.3.3 OsmiR535过表达转基因水稻的构建 211
6.3.4 OsmiR535过表达影响水稻发育 212
6.3.5 OsmiR535影响水稻OsSPLs 和穗发育相关基因表达 216
6.3.6 OsmiR535冷胁迫下的表达特性分析 218
6.3.7 OsmiR535过表达降低了水稻冷胁迫耐受性 218
6.3.8 OsmiR535通过ROS途径和渗透调节水稻性 220
6.3.9 OsmiR535调控CBF依赖的基因和OsSPLs 基因表达 221
6.4 讨论 223
6.4.1 miR535调控水稻发育机制探讨 223
6.4.2 miR535调控水稻非生物胁迫应答 225
6.5 结论 226
第7章 miR408调控水稻低温和干旱胁迫应答 227
7.1 研究背景 227
7.1.1 miRNA在调控植物非生物胁迫应答的研究进展 227
7.1.2 植物miRNA逆境胁迫分子机制研究进展 233
7.1.3 miR408的研究进展 234
7.2 材料与方法 236
7.2.1 实验材料 236
7.2.2 实验方法 237
7.3 结果与分析 238
7.3.1 OsmiR408冷胁迫和干旱胁迫下表达模式分析 238
7.3.2 OsmiR408过表达转基因水稻的获得 239
7.3.3 OsmiR408过表达提高水稻耐冷性 240
7.3.4 OsmiR408过表达降低了水稻耐旱性 242
7.3.5 OsmiR408靶基因预测及表达分析 243
7.4 讨论 249
7.4.1 miR408的表达模式 249
7.4.2 miR408耐逆的机制探讨 250
7.5 结论 252
第8章 展望 253
参考文献 257
附录A 281
编后记 300