神经元烟碱受体的结构
Francesca Fasoli and Cecilia Gotti
摘要 烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）是大脑胆碱能神经传递系统的重要组成部分，调节重要的生理过程，并且在神经退行性疾病和精神疾病患者中观察到其功能障碍。nAChR是由α和β亚基的五聚体组成的受体亚型异质性家族，并且在整个中枢和外周神经系统中广泛表达。nAChR亚型具有共同的基本结构，但它们的生物物理和药理学性质取决于其亚基组成，这对于理解神经系统中的受体功能和发现新的亚型选择性药物至关重要。本章综述有关nAChR（特别是天然亚型）结构和功能的*新发现。
关键词 神经元烟碱受体亚型，亚基组成，化学计量学，烟碱，α-银环蛇毒素，乙酰胆碱结合位点
1 引言
胆碱能系统是*重要且系统发育*古老的神经通路之一。乙酰胆碱（ACh）是由胆碱能神经元合成、储存和释放的神经递质，传递ACh信息的关键分子是毒蕈碱代谢受体和离子型神经元烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）（Picciotto et al.2012）。 nAChR是在中枢神经系统（CNS）中广泛表达的异质性离子通道家族，通过对内源性神经递质乙酰胆碱（ACh）和烟碱（*常见的滥用药物）的反应，参与多种生理过程（reviewed in Hurst et al.2013）。
当nAChR激活时，可以刺激靶细胞并介导自主神经节神经元和某些脑区的快速突触传递，但解剖学和功能学证据表明，脑中的nAChR优先分布在前末端和突触前位点，并在那里调节兴奋性和抑制性神经递质的释放（reviewed in Albuquerque et al. 2009; Jensen et al.2005）。
nAChR和烟碱机制有助于认知功能，在神经退行性疾病和精神疾病中观察到它们的衰退或功能障碍。此外，遗传学研究已将nAChR与癫痫和精神分裂症联系起来，对突变（敲除或敲入）小鼠的研究表明它们与疼痛机制、焦虑和抑郁有关（reviewed in Changeux 2010; Drenan and Lester 2012; Gotti and Clementi 2004; Hurst et al. 2013; Picciotto et al.2001）。nAChR在大脑生命的两个关键时期尤为重要：出生前和出生后的早期回路形成，以及与年龄相关的细胞退化。它们参与神经元存活，因为已经显示烟碱激动剂在体内和体外模型中都具有神经保护作用。此外，越来越明显的是，胆碱能烟碱性神经传递的干扰可导致发育、成年和衰老期间的各种疾病（Picciotto and Zoli 2008）。许多综述（Albuquerque et al.2009; Changeux 2009; Gotti et al. 2009）描述了nAChR的结构和功能，本章旨在简要概述有关大脑nAChR亚型结构的*新发现。
2 烟碱亚型的总体结构
nAChR*初通过配体结合试验使用放射性配体进行鉴定，结果显示125I-α-银环蛇毒素（αBgtx）和3H-烟碱与具有不同解剖学和药理学分布的受体结合（Clarke et al.1985）。
通过这些配体研究揭示的nAChR的药理异质性，随后通过分子克隆一个编码12个亚基的基因家族以及在异源系统中表达的研究中得到了证实和扩展（reviewed in Albuquerque et al. 2009; Dani and Bertrand 2007; Gotti et al.2006）。
nAChR属于同源受体的大型超家族，其还包括肌肉型AChRs和GABAA、甘氨酸和5-羟色胺（5-HT）离子型受体（reviewed in Gotti et al. 2009; Miller and Smart 2010）。与配体门控离子通道超家族的所有其他成员一样，nAChR亚基具有相对亲水的细胞外氨基末端，其携带ACh结合位点并面向突触间隙，随后是三个疏水跨膜结构域（M1～M3），一个大细胞内环，然后是第四个疏水跨膜结构域（M4）[图1(a)]（reviewed in Albuquerque et al，2009）。亚基围绕中心孔排列，并且定点诱变实验表明跨膜M2结构域排列离子通道，并确定了残基对受体的离子选择性、渗透性和通道门控的重要性。
在脊椎动物中，到目前为止已克隆的基因（CHRNA2～CHRNA10和CHRNB2～CHRNB4）编码亚基被分为9个α亚基（α2～α10）和3个β亚基（β2～β4）两个亚族，其在耳蜗和神经系统以及许多非神经元组织中表达（Gotti and Clementi 2004）。所有9个α亚基具有相邻的半胱氨酸（类似于肌肉型AChR的α亚基的半胱氨酸192～193），而β亚基不具有半胱氨酸。nAChR亚基的不同组合导致形成具有不同结构、功能和药理学性质的五聚体亚型异质家族。已经确定了两类主要的nAChR亚型：由α7，α8，α9和/或α10亚基组成的αBgtx敏感受体可以形成同源受体或异构体受体，αBgtx非敏感受体是由α和β亚基结合高亲和力但不含αBgtx的激动剂而形成的异构体受体[图1(b)]（reviewed in Gotti et al.2009）。
图1 （a）显示了nAChR亚基的推定跨膜拓扑结构。细胞外氨基末端之后是三个疏水跨膜结构域（M1～M3），一个大的细胞内环，然后是第四个疏水跨膜结构域（M4）。中图为nAChR亚基在组装受体中的五聚体排列。右图为异构体受体中ACh结合位点的示意图。（b）异构五聚体和同源五聚体神经元亚型的结构。nAChR亚基在α7同源受体亚型（左）、异构体受体亚型（中）和(α4)3(β2)2亚型（右）中的五聚体排列，显示了正构结合位点的亚基界面的定位，其中主要成分（P）由α亚基携带，互补成分（C）由α或非α亚基携带。除了两个正构位点外，(α4)3(β2)2亚型在α4/α4界面有一个结合位点（图中五角星所示）
对异源系统的研究表明，α7亚基也可以形成功能通道，其亚基存在于非αBgtx结合受体中，如α5（Gotti et al. 2009），β2（Khiroug et al. 2002），β3（Khiroug et al. 2002）和β4亚基（Criado et al. 2012）。推测同源和异构nAChR都具有五聚体结构，亚基围绕中心通道组织：同源寡聚体受体的每个受体分子具有五个相同的（正构）ACh结合位点[图1(b)]（Palma et al.1996）位于两个相邻亚基之间的界面，而异构寡聚体受体具有两个或三个α亚基和三个或两个β亚基，因此位于α和β亚基之间界面的每个受体分子有两个正构结合位点（Taly et al. 2009）[图1(b)]。每个正构的ACh结合位点具有主要（或“加”）和互补（或“减”）组分。在异构nAChR中，主要成分由α2、α3、α4、α6亚基所携带和β2或β4亚基所携带互补位点组成，而同源受体中的每个亚基都有主要和互补的成分，呈现于同一亚基的相对侧（reviewed in Corringer et al. 2000; Taly et al.2009）[图1(b)]。
异戊二烯神经元nAChR具有第五个亚基，其对正构位点没有贡献（并且该亚基被称为辅助亚基）。在异源系统中，α5和β3亚基只有在与主要和互补亚基共表达时才形成功能通道（Groot-Kormelink et al. 1998; Ramirez-Latorre et al.1996），因此表明它们只能作为辅助功能发挥作用。而α3或α4和β2或β4亚基可形成正构配体结合位点或在辅助位置组装以产生不同化学计量的受体[图1(b)]。
然而，*近的研究表明，结合位点的定义和可能涉及的亚基更加复杂。DNA共价连接受体的使用导致受体的表达，其亚基具有特定的顺序，其药理学特性与非连接受体相似（Nelson et al. 2003; Zhou et al. 2003）。对多联体(α4)3(β2)2亚型的研究表明，除α4/β2界面的两个正构结合位点外，它们还在α4/α4界面处具有另外的结合位点（Moroni et al.2008），如图1(b)所示。
Jin等（2014）*近使用多联体方法表达了α4和β2亚基的二聚体构建体，表达了游离的α5亚基和多联体五聚体，在不同的位置掺入单拷贝的α5，发现α5亚基可以占据非结合亚基的位置，或取代参与正位结合位点的β2亚基。然而，功能性受体显然不能在α?亚基的两个经典结合位点中形成。
2.1 正构乙酰胆碱结合位点
我们对激动剂结合位点的大部分知识来自肌肉AChRs的研究，其中使用亲和标记的试剂和亚基嵌合体和/或定点诱变已经表明它是有助于ACh结合结构域口袋的大的细胞外氨基末端结构域（Bartos et al. 2009; Taly et al. 2009）。此外，*近通过分析来自淡水蜗牛的ACh结合蛋白的晶体结构，已经对nAChR中的配体结合位点的鉴定作出了显著贡献（Celie et al. 2005; Rucktooa et al.2009）。这种210个长度的同源五聚体可溶性蛋白质（AChBP）结合ACh并被蜗牛神经胶质细胞分泌到胆碱能神经突触中，并具有类似于同源α7或α9受体的亲和光谱。
许多氨基酸残基有助于正构乙酰胆碱结合位点。它们被分组为形成环A、环B和环C（主要成分）以及环D、环E和环F（互补成分）的短序列[图2(a)]。在乙酰胆碱可溶性蛋白的紧密结构内，在两个相邻亚基的配体结合结构域（LBD）的界面的中心，环A、环B、环D和环F形成疏水口袋，激动剂结合到其上，由环C封闭[图2(d)]。使用烟碱配体对乙酰胆碱可溶性蛋白的共晶体的研究表明，结合位点中的保守残基是酪氨酸Y93（环B）、色氨酸W149和Y151（环A）、Y190和Y198（环C）、W55和E57（环D）以及半胱氨酸C192和C193之间的二硫键（编号是指电鳐AChRs中存在的氨基酸）（Changeux and Taly 2008）。ACh结合位点的芳族残基和二硫键是电负性的并且中和大多数烟碱配体携带的正电荷。因此，乙酰胆碱的结合在环B中的W残基的阳离子和富电子π体系之间产生非共价相互作用。通常，烟碱配体的叔胺或季铵电荷通过环A、环B、环C和环D的疏水芳香族残基与形成的口袋的中心结合。这种相互作用在乙酰半胱氨酸环状受体家族中维持，尽管所涉及的环依赖于受体类型(Miller and Smart 2010)。
图2 ACh结合位点的结构。(a)显示参与其形成的环中的氨基酸的乙酰胆碱结合位点。环A、环B、环C由α亚基提供，环D、环E、环F由相邻的亚基提供。(b～d)在烟碱存在下共晶的AChBP结合位点的X射线结构(b)(d)和拮抗剂甲基牛扁碱（MLA）(c)。激动剂结合在含有结合位点的口袋中，该结合位点促进配体和蛋白质之间的广泛接触。与其他拮抗剂的情况一样，甲基牛扁碱的结合导致环C（黄色）的开放构象，其干扰受体活化和通道开放(c)。经许可引自（Changeux and Taly 2008）
乙酰胆碱可溶性蛋白的X射线研究表明，在没有激动剂或存在拮抗剂的情况下，环C不覆盖疏水口袋，而在激动剂存在下，结合位点具有环C覆盖的闭环构象[图2(c)(d)]。通过对大多数乙酰胆碱可溶性蛋白与5-羟色胺（5-HT3）受体的跨膜区融合获得的嵌合体的研究，确定了环C在激活受体中的作用。该嵌合体发挥着乙酰胆碱受体的作用，其中乙酰胆碱结合决定了环C的闭合和受体的活化(Mukhtasimova et al. 2009)。
电生理学研究还确定了环C的运动和通道的开口之间的反馈通信。该研究还表明，一个ACh分子的结合在短时间内打开了通道，而两个分子的结合延长了开放时间(Mukhtasimova et al. 2009)。因此，似乎
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