胡银岗教授，多年从事小麦温敏雄性不育的分子基础及杂种优势利用和作物抗旱节水性的遗传改良研究。先后主持完成教育部重点科研项目“YS型小麦温敏雄性不育的遗传基础研究”、春晖计划启动项目“YS型小麦温敏雄性不育育性转换的分子基础”、国际合作重点项目“小麦抗旱性改良的生理生化分子基础”、聘请外籍教师重点项目“抗旱节水小麦种质筛选技术研究与利用”，科技部973计划前期专项“小麦抗病和抗旱的功能基因学与分子基础研究”等。目前主持澳大利亚政府ACIAR项目“提高中国和澳大利亚旱地小麦水分利用效率”，参加科技部863计划重点项目子课题“农业高效用水精量控制技术与产品”、欧盟第七框架项目“育种优化中国农业”等。

《作物基因工程：原理与技术》是为适应作物遗传育种、种子工程等农学相关专业研究生教学的需要而编写的。为了更好地符合研究生课程的特点及满足其即将开始的学位论文工作的需要，《作物基因工程：原理与技术》侧重作物，依照基因工程的流程详细讲解作物基因工程各个环节的基本原理与技术。主要包括：概论；基因工程主要工具的原理与技术；目的基因的克隆策略及各个策略中目前常用技术的原理与要点；作物基因工程表达载体构建的原理与技术，以及作物基因工程中常用的表达载体系统的特点及表达载体的构建；作物遗传转化受体系统的建立和常用的作物遗传转化方法及其特点；作物转基因植株鉴定的主要方法、特点及合理利用，转基因的遗传特性及转基因作物种质材料利用的主要途径与方法；作物基因工程的安全性及其评价；以及作物基因工程中常用的实验技术等内容。

第一章基因工程概论
基因工程（genetic engineering）也称基因操作（gene manipulation）、DNA重组技术（DNA recombination technology），是在分子生物学和分子遗传学等学科交叉发展的基础上，于20世纪70年代诞生的一门新的生物技术科学。它的创立与发展直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，两者之间有着密不可分的内在联系。可以说，基因研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生则是基因及其研究发展的必然结果，而基因工程的发展与应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，进一步提高我们对基因本质的认识。因此，在介绍基因工程之前，有必要简单地回顾一下基因及其研究的发展过程。
第一节基因及其研究历程
从20世纪开始，基因研究一直是影响整个遗传学和分子生物学发展的主导因素。根据不同历史时期的水平和特点，基因研究大体上可分为三个发展阶段：在20世纪50年代以前，主要在细胞的染色体水平上，为基因的染色体遗传学（或细胞遗传学）阶段；20世纪50年代之后，特别是发现DNA双螺旋结构后，主要在DNA分子水平上，为基因的分子生物学阶段；20世纪70年代以来，随着DNA重组技术的完善和应用，基因的研究由传统的表现型分析到基因型分析，通过基因克隆、构建、表达等手段研究基因的结构、功能与调控及其与表现型间的关系，基因研究进入了基因组学研究的新阶段。
一、 基因学说的创立
遗传因子（hereditary factor）最初是由孟德尔（G Mendel）提出的。他根据长期的实验观察结果，推想生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些遗传因子从亲代到子代，代代相传；在体细胞中，遗传因子是成对存在的，其中一个来自父本，一个来自母本；在形成配子时，成对的遗传因子彼此分开，因此，遗传因子在性细胞中则是单个存在的；在杂交子一代体细胞中，成对的遗传因子各自独立，彼此保持纯一的状态；在形成配子时，它们彼此分离，自由组合，完整地传给后代；由杂交形成的不同类型的配子数目相等；雌雄配子随机结合。从而奠定了遗传学的独立分配和自由组合这两大遗传规律。
1909年，丹麦生物学家约翰生（W Johannson）根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因（gene）一词，并用这个术语来代替孟德尔的“遗传因子”。不过，他所说的基因并不代表物质实体，而是一种与细胞的任何可见形态结构毫无关系的抽象单位。因此，那时所指的基因只是遗传性状的符号，还未涉及基因的具体物质。
1910～1915年，美国遗传学家摩尔根（T H Morgan）通过果蝇试验，首次将代表某一性状的基因同特定的染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论（chromosomal theory of inheritance）。随后遗传学家应用当时发展的基因作图（gene mapping）技术，构建了基因的连锁图，进一步揭示了基因在其载体染色体上是按线性顺序排列的，从而使得科学界普遍接受了孟德尔的基因学说，也由此确定了遗传学的连锁遗传规律。
二、 基因与DNA分子
尽管基因学说得到了普遍的认可，但是人们对基因的认识仍然缺乏准确而具体的物质内容。直到1944年，美国微生物学家埃弗利（O T Avery）等通过细菌转化研究，证明基因的载体是DNA而不是蛋白质，从而确立了遗传的物质基础，即DNA分子是遗传信息的载体。1952年，美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家A D Hershey等利用双同位素标记的噬菌体感染大肠杆菌宿主细胞的试验验证了Avery的结论。
1953年，美国遗传学家沃森（J Watson）和英国生物学家克里克（F Crick）揭示了脱氧核糖核酸（DNA）分子的双螺旋模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递问题。至此，基因不再是一种只能用遗传实验手段进行研究的神秘成分，而是一种真正的物质分子，对它能够像对其他大分子一样进行研究，从而开辟了基因的分子生物学研究新时代。
DNA分子是基因的载体，那么是否每一段DNA都是基因呢？按照经典的基因概念，在染色体或DNA分子上，基因是呈串珠状一个挨一个排列的，它们之间由非遗传的物质连接起来。交换只是在基因之间进行，而不是在基因内部发生。换言之，基因既是遗传的功能单位，也是交换单位和突变单位。但是，许多研究表明，基因并不是交换和突变的最小单位，基因内部也有不同的功能单位。1955年，S Benzer使用“顺反子”（cistron）这个术语表示基因，每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或者说是相当于一个基因的DNA或RNA单元，它编码一条完整的多肽链。这种多肽链既可以是一种具有生物活性的蛋白质，也可以同其他多肽聚合形成多功能的蛋白质。顺反子是功能单位，由许多可以突变的位点组成，这些位点之间也可以发生交换。如同染色体上基因呈线性排列，DNA分子上的基因也是线性排列的。
在现代的遗传学文献中，顺反子和基因这两个术语是通用的。一般来说，一个顺反子即一个基因，大约含有1500个核苷酸序列，是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构。基因不是最小单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区即外显子（exon），其余部分称之为内含子（intron）。
一般来说，从细菌到高等植物的全部生命有机体，它们的基因都是由DNA构成的，由于所有生物的DNA的基本结构都是一致的，来自两种生命形态的基因（DNA）可以融为一体。因此，基因的DNA共性是基因工程的第一个重要理论基础。
但还必须指出，随后的研究工作表明，在生物界并非所有的基因都是由DNA构成的，某些动物病毒、植物病毒及某些噬菌体等，它们的遗传物质基础是RNA而不是DNA。例如，A Gierer和G Schramm在研究烟草花叶病毒（TMV）时，发现了RNA分子能够传递遗传信息，同时还证明TMV病毒的RNA在感染的植株叶片中能够诱导合成新的病毒颗粒。
三、 基因中遗传信息的传递与表达
1958年，F Crick综合分析了关于遗传信息流转向的各种资料，提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的中心法则（central dogma）。根据这个法则，如图11所示，遗传信息是从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白质的。在DNA的复制过程中，它的双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）的模板；而在DNA到RNA的转录过程中，DNA是作为指导RNA合成的模板，按照碱基互补配对的原则合成一条RNA链。实验证明，细胞内DNA的两条链中，只有一条具有转录活性，另一条则只能进行复制而无转录功能。在从RNA到蛋白质的翻译过程中，RNA又作为合成蛋白质氨基酸序列的模板，指导多肽链的合成。中心法则认为，遗传信息一旦转移到蛋白质分子，之后就不能再由蛋白质传向蛋白质，也不能由蛋白质传向DNA或RNA。随着分子生物学研究的深入，发现很多RNA病毒，如流行性感冒病毒及大多数单链RNA噬菌体等，在感染了宿主细胞之后，都能够进行RNA的复制。1970年，H M Temin和D Baltimore发现，一些RNA肿瘤病毒在宿主细胞中的复制过程是先以病毒的RNA分子为模板，在反转录酶的作用下合成DNA互补链，然后以该DNA链为模板合成新的病毒RNA，也就是说，遗传信息可以从RNA反向传递到DNA。于是，1971年F Crick根据新的进展修改了中心法则，提出了更为完整的图解模式（图12）。
图11遗传信息的流向
图12修改后的中心法则


图12中的实线箭头表示三种存在于绝大多数生物细胞中的遗传信息的传递方向。虚线箭头表示特殊情况下的遗传信息的传递方向，只存在于极少数的生物中。而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递只是一种理论上的可能性，迄今尚未得到证实。基因中遗传信息传递与表达的共性是进行基因工程操作的又一个基石。
四、 基因与蛋白质多肽链
基因是细胞中所有的RNA及蛋白质分子的“蓝图”。有些基因编码的最终产物是RNA分子，如rRNA基因、tRNA基因及其他小分子RNA基因等，而其他基因编码的最终产物则是多肽，这些蛋白质是通过mRNA中介合成的。
1941年，G W Beadle和E L Tatum在分析了有关红色面包霉的大量研究结果之后，认为生物体内发生的每一步代谢反应都是由一种特殊的酶控制的，而这种酶又是某一特定基因的合成产物，提出了“一种基因一种酶”假说（hypothesis of one gene to one enzyme）。一旦基因发生突变，那么由它指导合成的蛋白质也将随之发生变化，甚至可能导致活性的丧失，从而把基因的功能同蛋白质的作用联系了起来。
1957年，英国科学家V M Ingram对镰状细胞贫血（sickle cell anemia）的血红蛋白和正常的血红蛋白的氨基酸序列进行了对比研究，第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系。进一步表明基因的突变会直接影响到它编码的蛋白质多肽链的改变。
通过对蛋白质结构的研究发现，许多种蛋白质都是由多个亚基组成的，这类蛋白质称为多聚体蛋白质（multimeric protein）。在多聚体蛋白质中，如果所有的亚基都是同样的，这种蛋白质就属于同型多聚体（homomultimer）蛋白质，由一种基因编码。如果这些亚基各不相同，这种多聚体蛋白质便属于异型多聚体（heteromultimer）蛋白质，由多种基因编码，如1个血红素是由2个α亚基和2个β亚基组成的一种异型多聚体蛋白质。每种类型的亚基都是一种不同的多肽链，是不同基因编码的产物。为了能够适用于任何一种异型多聚体蛋白质的情况，“一种基因一种酶”的表述后来便被修正为“一种基因一种多肽链”（one gene to one polypeptide chain），以更加准确地反映基因的本质。
五、 基因碱基序列与蛋白质氨基酸序列
翻译与转录不同，不是简单的核苷酸序列的抄写，而是将RNA分子的核苷酸翻译成蛋白质分子的氨基酸的复杂过程，涉及两种不同信号之间的转换问题。因此，在翻译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码（genetic code）系统，才能够将RNA分子的核苷酸序列同蛋白质分子的氨基酸序列联系起来。
经过许多人的共同努力，特别是F Crick和S Brenner的出色工作，1961年年底，有关遗传密码的主要问题都已经得到了解决。第一个问题是密码比（coding ratio），遗传实验证实，由3个碱基编码1种氨基酸，这种碱基三联体称为密码子（codon）。第二个问题是密码是否重叠，研究表明遗传密码是不重叠的。第三个问题是相邻的2个三联体之间是否存在着“逗号”，碱基的缺失和插入突变研究证明，碱基的阅读是从一个固定的起点按顺序进行的。
1964年，M W Nirenberg和J H Matthaei等通过体外翻译体系，成功破译了大部分密码子。1966年，H G Khorana利用重复的共聚体等破译密码子的途径，发现了3个终止密码子：UAA、UAG、UGA，它们不代表任何氨基酸，而表示链的终止。至此，所有64种密码子便已全部破译出来。遗传密码的破译，是基因和分子生物学研究中最激动人心的成就之一。
迄今为止，除在线粒体和叶绿体中存在着个别例外，所有生物（包括病毒、原核生物和真核生物）的密码子同氨基酸之间的关系都是一样的，遗传密码是通用的，遗传密码的通用性是基因工程的又一重要理论基础。
六、 基因的结构与功能
基因是编码遗传信息的基本遗传单位。从生物化学的角度看，基因是一段具有特定结构和功能的连续的DNA序列，是构成巨大遗传单位染色体的重要组成部分。没有基因就没有生命，要全面深入地了解任何生命过程，就必须对基因的结构及其功能进行详尽的研究。
1955年，S Benzer发展了应用T4噬菌体rⅡ区的不同等位基因绘制基因内部图谱（intragenic map）的方法，并证实了基因的最小突变单位和重组单位都是DNA的1 b

目录
序
前言
第一章基因工程概论1
第一节基因及其研究历程1
一、 基因学说的创立1
二、 基因与DNA分子2
三、 基因中遗传信息的传递与表达3
四、 基因与蛋白质多肽链3
五、 基因碱基序列与蛋白质氨基酸序列4
六、 基因的结构与功能4
七、 基因的表达与调控6
八、 基因的分离与克隆7
九、 基因的构建与表达8
第二节基因工程的发展9
一、 理论上的三大发现9
二、 技术的三大发明10
三、 植物基因工程的发展简史11
第三节基因工程的概念与主要内容12
一、 基因工程的概念和特点12
二、 作物基因工程的主要研究内容13
第四节作物基因工程的应用16
一、 作物基因工程的应用现状16
二、 转基因作物商业化中存在的问题18
思考题18
参考文献18
第二章基因工程的工具20
第一节植物核酸及蛋白质的分离与制备20
一、 植物核酸的制备20
二、 植物蛋白质的分离与纯化25
第二节凝胶电泳的基本原理28
一、 凝胶电泳的基本原理29
二、 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳29
三、 RNA的变性凝胶电泳30
四、 脉冲电场凝胶电泳31
五、 核酸凝胶电泳的常见问题32
六、 蛋白质的凝胶电泳33
第三节基因工程的工具酶33
一、 限制性内切核酸酶（限制酶）34
二、 甲基化酶37
三、 DNA连接酶37
四、 DNA聚合酶39
第四节分子杂交技术43
一、 DNA印迹法43
二、 RNA印迹法45
三、 斑点印迹法和狭线印迹法45
四、 菌落印迹或噬菌斑印迹46
五、 基因芯片杂交47
第五节PCR基因扩增技术47
一、 PCR的原理47
二、 PCR反应体系48
三、 PCR条件的选择49
四、 PCR条件的优化50
五、 常用PCR技术及其应用50
第六节基因工程的载体51
一、 质粒载体52
二、 λ噬菌体和M13噬菌体载体54
三、 cosmid（柯斯质粒）和phagemid载体系列56
四、 酵母载体58
五、 农杆菌Ti质粒载体60
六、 植物病毒载体62
第七节文库构建的基本原理及应用63
一、 基因组文库与cDNA文库64
二、 克隆文库及表达文库65
三、 减法文库65
四、 亚克隆文库65
第八节核酸与蛋白质测序的原理与技术65
一、 DNA测序技术65
二、 蛋白质测序技术69
第九节生物信息学技术72
一、 生物信息学数据库72
二、 数据库查询73
三、 数据库搜索74
四、 基因序列分析75
五、 电子克隆技术76
思考题77
参考文献78
第三章目的基因的克隆与功能分析79
第一节基因组策略79
一、 基因组文库筛选目的基因79
二、 图位克隆目的基因83
三、 突变体分析克隆目的基因89
四、 已知DNA片段侧翼基因组序列的分离96
第二节转录组策略100
一、 mRNA差异显示分析筛选目的基因101
二、 cDNA文库筛选目的基因103
三、 基因表达系列分析（SAGE）筛选目的基因106
四、 基因芯片分析筛选目的基因108
五、 cDNA末端的快速克隆（RACE技术）110
第三节功能蛋白质组策略分离基因112
一、 功能蛋白质组策略概述112
二、 蛋白质双向电泳技术113
三、 功能蛋白的鉴定及氨基酸序列分析115
四、 功能蛋白基因的分离119
第四节目的基因分离的策略123
一、 目的基因分离的策略123
二、 基因分离克隆策略的选择123
第五节基因功能的初步分析与鉴定124
一、 通过mRNA检测分析基因的表达谱 124
二、 通过检测蛋白质分析基因的表达特征125
三、 通过功能获得和（或）功能缺失分析基因功能125
思考题126
参考文献126
第四章基因表达载体的构建128
第一节基因的表达与调控128
一、 基因表达调控是生命活动的必需128
二、 原核生物的基因表达与调控129
三、 真核生物的基因表达调控133
第二节目的基因的表达与功能分析137
一、 目的基因功能与表达分析的策略137
二、 基因表达载体构建的基本原理138
第三节农杆菌Ti质粒转化载体的构建146
一、 根癌农杆菌研究的历史146
二、 Ti质粒的结构147
三、 TDNA的结构与功能152
四、 基于Ti质粒的转化载体的系统演化157
五、 Ti质粒载体的构建策略161
六、 常用Ti质粒双元载体的构建163
第四节植物基因表达载体构建实例171
一、 植物基因表达载体构建和优化策略171
二、 基因表达载体构建的实例176
三、 选择标记基因和报告基因的特点与选择181
第五节植物病毒载体的构建185
一、 基于基因组操作的植物病毒表达载体185
二、 基于基因转录机制的病毒表达载体186
三、 VIGS载体的构建及应用187
四、 植物病毒载体的应用190
第六节基因沉默技术原理190
一、 RNA干扰技术原理和应用191
二、 基因定点敲除技术192
思考题197
参考文献197
第五章作物的遗传转化与转化体筛选199
第一节作物基因转化受体系统199
一、 作物基因转化受体系统的条件199
二、 作物基因转化受体系统的类型及其特性201
三、 作物基因转化受体系统建立的程序203
四、 作物基因转化受体系统建立中的常见问题205
第二节农杆菌介导的遗传转化207
一、 农杆菌的生物学特性208
二、 常用根癌农杆菌及其特性208
三、 根癌农杆菌介导的转化程序209
四、 影响根癌农杆菌TDNA转移的因素209
五、 根癌农杆菌介导的遗传转化技术213
六、 根癌农杆菌转化系统评价219
第三节基因枪介导的遗传转化 219
一、 基因枪法的原理及其优缺点219
二、 基因枪转化小麦未成熟胚的技术流程220
三、 注意事项222
第四节花粉管通道介导的遗传转化222
一、 花粉管通道法的技术原理223
二、 花粉管通道法的操作程序223
三、 花粉管通道法的应用224
第五节其他常用遗传转化方法225
一、  显微注射法225
二、 聚乙二醇（PEG）介导法227
三、 电穿孔法229
四、 病毒介导的遗传转化230
参考文献232
第六章转基因植株的鉴定及利用234
第一节转基因植株鉴定的策略234
一、 转基因植株鉴定的证据234
二、 外源基因的检测与鉴定策略234
三、 转基因植株鉴定的步骤235
第二节选择标记基因与报告基因的检测235
一、 抗抗生素类236
二、 抗除草剂类237
三、 报告基因类238
第三节目的基因的检测与分析240
一、 分子杂交240
二、 转基因植物的PCRSouthern blotting检测242
三、 外源基因表达水平的RTPCR检测243
四、 外源基因拷贝数的检测244
五、 外源基因检测的衍生方法246
第四节目的基因的整合及效应247
一、 转基因植物中外源DNA的整合特性247
二、 转基因植物中外源DNA整合的遗传效应251
三、 提高外源基因表达效率的策略252
第五节目的基因的遗传特性254
一、 转基因的遗传传递规律254
二、 转基因的遗传稳定性259
三、 外界环境对转基因遗传特性的影响261
第六节作物转基因材料在育种中的应用261
一、 回交育种261
二、 转基因材料回交育种的特点266
三、 转基因快速、定向育种技术（以小麦为例）267
思考题269
参考文献270
第七章作物基因工程的安全性评价272
第一节基因工程安全性的争论272
一、 问题的由来272
二、 初步对策——安全准则273
第二节转基因作物的安全评价274
一、 为什么要对转基因作物进行安全性评价？274
二、 转基因作物安全性评价的主要内容275
三、 国内外转基因作物的安全性评价概况280
第三节转基因作物——恶魔还是救星281
思考题282
参考文献282
附录作物基因工程主要实验技术284
一、 植物基因组DNA提取284
二、 植物基因组DNA的纯度检测285
三、 基因的PCR扩增287
四、 质粒DNA的线性化与连接重组288
五、 重组DNA的遗传转化290
六、 质粒DNA的电泳检测291
七、 植物总RNA的提取292
八、 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳294
九、 植物组织全蛋白的提取295
十、 植物可溶性蛋白含量的考马斯亮蓝染色法测定296
十一、 植物可溶性蛋白含量的紫外吸收法测定298
十二、 禾谷类作物种子醇溶蛋白的毛细管电泳300
十三、 禾谷类种子醇溶蛋白APAGE鉴定301
十四、 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析303
十五、 植物组织蛋白质的双向电泳304
十六、 小麦的SSR分子标记分析308
十七、 小麦BSMVVIGS解析基因功能310
十八、 作物基因工程综合大实验312
参考文献319