2.液一液分配层析
液一液分配层析的固定相由单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上,经酸洗、中和、干燥活化,使表面保持一定的硅羟基,这种以化学键合相为固定相的液一液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液一液分配层析为离子对层析。
(1)化学键合相层析
①极性键合相层析:固定相为氰基、氨基及双羟基三种极性基团,流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组分先出峰,极性大的组分后出峰,称为正相层析法,适用于分离极性化合物。
②非极性键合相层析:固定相为非极性基团,如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基与苯基等,流动相用强极性溶剂,如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂,水不仅起洗脱作用,还可掩盖载体表面的硅羟基,防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组分先出峰,极性小的组分后出峰,恰好与正相层析法相反,故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离,如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。
(2)离子对分配层析
①正相离子对层析:此法常以水吸附在硅胶上作为固定相,把与分离组分带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中,待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对,在水相和有机相中进行分配,而达到分离。本法优点是流动相选择余地大,缺点是固定相易流失。
②反相离子对层析:固定相是疏水性键合硅胶,如C18键合相,待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中,生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配,而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题,流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。
3.离子交换层析
离子交换层析的原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中,固定相多用离子性键合相,故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液,pH最好在被分离酸、碱的pK值附近。
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