(二)间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping) Spoligo-typing方法以染色体直接重复序列位点(direct repeat locus,DR)多态性为基础。结核分枝杆菌的直接重复序列区包括10~50个直接重复序列,每个直接重复序列包含36个碱基对,直接重复序列被不同的大小在35~71bp范围内的间隔区寡核苷酸序列分隔。任意两个直接重复序列间的寡核苷酸序列具有很高的保守性。由于不同菌株间隔区寡核苷酸序列存在多态性,因此间隔区寡核苷酸序列可用于区分不同的结核分枝杆菌,此方法称为Spoligotyping。
Spoligotyping相对于IS6110 RFLP方法有2个优点:首先,由于Spoligotyping只需要少量DNA,因此可直接应用于临床标本;其次,Spoligotyping的结果被表示为每个间隔为阳性或阴性,可用一种数字形式表示,因此结果分析简单,而且数字化结果便于不同实验室间交换实验结果。但是,Spoligotyping分辨力较低,尤其不适用于存在优势菌株的区分,如在东南亚和我国普遍流行的具有相同遗传背景的北京基因型菌株,需要用其他方法进行分型。
(三)数目可变串联重复序列分型 数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)分型方法是新近发展的以PCR技术为基础的一种基因型分型方法。基因组中重复序列的数目在不同菌株间具有多态性,而重复序列的大小及两侧的序列高度保守。因此可以通过比较VNTR位点的重复序列的数目来区分不同的菌株。结核分枝杆菌散在分布的重复单位(mycobacterialinterspersed repeat units,MIRUs)是VNTR分型方法的一种,MIRU位点是在结核分枝杆菌基因组中散在分布的41个重复序列,重复单位的大小在46~100bp之间,其中12个MIRU位点在不同菌株间具有重复序列数目的多态性,因此可以作为VNTR位点进行基因型分型。
由于其具有较好的重复性,并且操作简便,快速出结果,花费低,同时,数字化的结果便于不同实验室间交换实验结果,因此VNTR基因型分型方法逐渐被推广应用。VNTR分型方法的分辨力取决于所采用位点的分辨力:包括越多高分辨力位点,该方法的分辨力越高。但是由于不同地区流行菌株遗传背景的差异,VNTR不同位点的分辨力在不同地区差异很大。因此,近几年很多研究都在鉴定适合于该地区的具有高分辨力的’VNTR位点。最近,Zhang等提出了适合我国地区的16个位点和7个位点分型方案,其分辨力与IS6110 RFLP相当。
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