由于果蝇雌性生殖系统的受精囊（spermatheca）可保留交配所得的大量精子使大量的卵受精。因此在作杂交试验时，雌性亲本必须选用处女蝇，即刚刚由蛹羽化的雌蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，在6～8 h之内没有交配能力。或经过5-7 d隔离饲养，没有与任何雄性果蝇交配过的果蝇都属于处女蝇。
收集处女蝇的方法：
1.将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔6～8 h收集刚羽化的成虫，将准确鉴别性别的雌性和雄性果蝇分别放人培养瓶中备用。
2.由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，可以看到腹腔内的黑色消化道，可观察到黑色消化道的雌性个体为处女蝇。
3.用鉴别雌性蛹的方法收集处女蝇：根据黑腹果蝇雄蝇第一对足第一跗节内侧具有性梳的特征，蛹期亦可利用这一特征来鉴别性别。用带一滴生理盐水的解剖针小心地挑取黑色蛹，放在浸过生理盐水的滤纸条上，在解剖镜下进行观察：透过蛹的几丁质外壳，可见黑色蛹的头部是一对角状的前气门，头的两侧是一对红色复眼。蛹的背面可见排列整齐的已发育的刚毛。在蛹的腹面中部可见在其两侧呈黑色折叠状的双翅之间整齐而清晰地排列着发育完善的3对足。位于前端的那一对足的第一跗节处清晰可见“一对块状的黑色结构”这便是雄性果蝇的性梳。不具此结构者为雌性。将雌性蛹逐个转移到一张潮湿的滤纸条上，小心地插入新鲜培养基，经培养一定时间以后羽化出来的果蝇均为可用于杂交的处女蝇（处女蝇蛹的羽化率低）。
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