1937年7月7日，日本全面侵华战争爆发。杨靖宇和南满省委决定，全力钳制日军入关南下，以配合全国抗战。他领导抗日联军一路军各部，频繁袭击日军据点，焚烧敌人仓库，破坏敌军工设施，截击敌军用车辆，有力地牵制了敌人。他和他领导的抗日联军一路军一时间名扬全国，受到中共中央的高度重视。杨靖宇和抗日联军一路军的游击活动，严重地威胁着日本侵略者在东北的殖民统治。1938年下半年起，日军调集重兵“围剿”抗日联军部队，妄图掐断抗日联军部队的粮食供给，并以万元巨金悬赏索要杨靖宇的头颅。抗日斗争进入异常艰难的时期。在敌强我弱的情况下，杨靖宇率部转移到人烟稀少的河里地区。
这里山高林密，气候寒冷，严冬来临，气温常达零下四十摄氏度。他率领战士们在冰天雪地里行军作战。宿营时，他们在山沟里、树丛下，席地而坐，围火而眠，倍感“火烤胸前暖，风吹背后寒”之难。缺乏粮食被服，成了最大难题。许多抗日联军战士没有倒在枪林弹雨中，却死在冻饿下。在这严酷的斗争形势下，杨靖宇仍精神饱满，坚毅乐观。有些同志为了他的安全，建议司令部撤到长白山里，但被他婉言谢绝了。他对同志们说：“我们抗日联军是抗日的队伍，我们存在一天，就要同敌人战斗一天，就是死，也要死在抗日的疆场上。”此时，杨靖宇倍加爱护干部、战士。1938年冬，杨靖宇派当时任连长的范德林去执行一项任务。范德林来到后，杨靖宇向他交代了任务，然后就脱下身上那条破旧的薄棉裤塞给范德林，把温暖和生存的希望留给了同志。由于日军封锁，杨靖宇同中共中央失去了组织上的联系。
中共中央一直关心着东北抗日军民，1939曾派人寻找杨靖宇和抗日联军一路军，拟传达《论持久战》和中央关于东北抗日联军发展方向以及杨靖宇工作安排的指示，但因敌人封锁未能如愿。杨靖宇也先后数次派入、致函同中共电央联系，也都没有成功。在这种情况下，杨靖宇只得根据自己对党的路线、方针、政策的分析、理解，凭着坚强的党性，凭着对祖国和民族的无限热爱，如P27同中流砥柱，独立地领导和坚持南满的抗日斗争。1938年12月，杨靖宇在潆江、桦甸交界的“密营”里，先后举办了两期党员和排长以上干部训练班，进行时事政治和文化知识教育。他报告了长白山区的抗日斗争情况，根据仅有的几份报纸分析世界反法西斯斗争形势。他动员大家应看到光明前途，坚定战胜艰难险阻，完成抗日救国大业的决心和信心。训练班对凝聚部队，在艰苦环境里坚持对敌斗争，起到了积极作用。他还创作了《东北抗日联军第一路军歌》、《西征胜利歌》、《中朝民族联合抗日歌》等歌词；鼓舞士气：“勇猛冲锋，吉凶祸福，并非天来定。事在人为，诚至金开，自有曙光逢……”“山河欲裂，万里隆隆，大炮的响声，帝国主义宰割弱小民族的象征。国既不国，家何能存，根本没有和平。黑暗光明，生死线上，斗争来决定。崛起呀！中朝民族，万不要再酣梦……”1939年，杨靖宇为了配合全国抗战，在极为艰难的环境中，领导抗日联军一路军主动出击。据日本侵略军统计，这一年，抗日联军战斗次数为五百四十次，其中抗日联军主动出击占百分之六十以上，令日军头痛不已。入秋以后，南满地区抗日形势更加险恶。
10月，日伪当局颁布《通化省三九年治安肃正指导纲要》，对杨靖宇领导的抗日联军发动了伪通化省、间岛省、奉天省“三省联合大讨伐”。参加“大讨伐”的日本关东军、伪“满洲国”军和伪警察达两万五千名，而杨靖宇领导的抗日联军第一路军只有三干人，既没有重武器，也没有外援。敌人调重兵占据辑安、临江、濛江、抚松、桦甸、延吉等大小城镇和山村据点，派大批日伪军警特封锁游击区。他们对抗日联军分割包围，采用所谓“蓖梳式”、“踩踏式”的堵击、长追、奇袭等战术，搞分区“拉网”和轮番“扫荡”。还派出了“长岛工作班”以及叛徒程斌、崔肖峰、唐振东等人带领的十一支装备精良的特殊警察大队，像“狗蝇子”一样死死盯住以杨靖宇为首的第一路军司令部，穷追不舍。为了对付杨靖宇的队伍，日军和伪“满洲国”军砍伐森林，在山地上开出道路，坐在卡车上追赶，抗日联军可以P28利用的自然屏障范围越来越少。敌人为了隔开游击队与一般居民，把可能帮助抗日联军的村民全部强制转移，在村与村之间全部钉上栅栏，派军警守备，让弹尽粮绝的抗日联军第一路军孤军苦战。在日伪军这次残暴、狠毒的“大讨伐”中，东、南满地区抗日斗争形势日趋恶化，一路军的游击区域不断缩小，不得不转入长白山地区的高山密林地带，陷于异常艰难困苦的境地。为粉碎敌人的“大讨伐”，1939年10月1日至5日，杨靖宇在桦甸县头道溜河，召开了中共南满省委和一路军主要领导人会议，决定将部队化整为零，分散游击，继续向东移动。杨靖宇率直属部队和一方面军进出于辑安、通化、抚松、柳河、金川、辉南、濛江地区，吸引正面敌人，掩护部队分兵和二、三方面军东移。在全军困难时刻，杨靖宇把突围之路安排给别人，把困难和危险留给自己。后来，抗联一路军牺牲最大的部队正是杨靖宇率领的执行断后任务的直属部队和一方面军，他们直接牵制敌军达万人。冰天雪地中，抗日联军部队缺食缺衣，生命面临饥寒和敌人“围剿”的双重威胁。1940年初，为了筹集给养，杨靖宇率队袭击了濛江县敌人重要据点龙泉镇，缴获部分粮食及其他军需物品。当敌人得知杨靖宇率队在濛江县活动的情报后，派伪通化省警务厅长岸谷隆一坐镇濛江，调集日军大原、有马、渡边、小滨、有政等部队，在濛江到处张罗布网，对杨靖宇及一路军总司令部展开疯狂的“围剿”。
1月21日，抗日联军一路军在漾江县马家东南方密林处与敌“讨伐队”作战时，警卫旅一团参谋丁守龙负伤后被敌人逮捕并叛变。丁守龙全盘出卖了杨靖宇的行迹、去向、计划和策略。敌人如获至宝，放弃对抗日联军其他小部队的“围剿”，集中全力“追剿”杨靖宇。2月1日，跟随杨靖宇多年的警卫排排长张秀风投敌，进一步暴露了杨靖宇的行踪。到了2月15日，杨靖字身边只有六名战士。他命黄生发等四名负伤战士转移。黄生发等几名战士不肯走，死活要和杨司令在一起。杨靖宇郑重地叮嘱说：“同志们，为了革命，我们要坚持到底。就是死，也不能泄露党的机密，也不能向敌人屈服，革P29命总是会胜利的！”黄生发等人只好执行命令，含泪而去。2月18日，杨靖宇率最后两名战士来到漾江县城东南大东沟。在寻找食物过程中被敌人发现，两名战士不幸牺牲。敌人从他们身上发现了杨靖宇的印鉴，断定杨靖宇就在附近，于是加紧搜索，进一步缩小了包围圈。
2月23日，北风卷着飞雪，疯狂地扫荡着吉林省濛江县的山山岭岭，气温达零下二十多摄氏度。杨靖宇只身来到保安村附近的三道崴子，碰到几个打柴人，便请他们代买粮食、棉鞋。这几人中有一个是伪满“牌长”，回村便告密。日军“讨伐队”迅速来到，两百名日军将已无力奔跑的杨靖宇包围在一片树林中。此时，杨靖宇孤身一人，而且病魔缠身，几天没有吃饭，但仍然与目军进行着殊死搏斗。敌人认为，杨靖宇单枪匹马，身陷重围，逃走已不可能。于是，他们想活捉杨靖宇，以此打击抗日联军的士气。日军停止了射击，让叛徒尹夏太等人对杨靖宇喊话劝降：“你的命要紧，抵抗没用了，快投降吧！你如果归顺，皇军大大地重用！”“杨靖宇，归顺吧！现在就剩你一个人了，再抵抗是没有用的！”在日军的围攻下，在叛徒声嘶力竭的劝降声中，杨靖字面无惧色，瞄准喊叫的敌人不停地点射，血战一个多小P30时。敌人彻底绝望了，日军指挥官大阪发狂似的下了射击命令。
各部敌人听到命令，马上包围上来。步枪、机枪一齐开火……枪声过后，整个山谷的空气像凝住了似的。低低的林涛如泣如诉，发出阵阵悲凄的哀鸣。杨靖宇靠在树旁，带着壮志未酬的遗憾，壮烈殉国！他那被敌人子弹穿透的胸膛，汩汩流出殷红的鲜血，染红了落叶，染红了雪地。对于当时的战斗情况，日军留下这样的记录：日军逐步逼近到五十米处，劝其投降，“他连答应的神色也没有，依然用手枪向讨伐队，射击”，“讨伐队”连续有五人中弹，一死四伤。日军见生擒困难就猛烈开火。被围者左腕中弹，一支手枪落地后，仍以右手持驳壳枪应战。终于有一弹贯穿他的胸部，他“被打倒而绝命”，手里仍紧握着驳壳枪！
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