第1章 用于直接监测神经细胞对抑制剂反应的AlGaN/GaN传感器
Irina Cimalla
伊尔梅瑙工业大学，微纳米技术研究所，德国伊尔梅瑙
MichaelGebinoga
伊尔梅瑙工业大学，微纳米技术研究所，德国伊尔梅瑙
Andreas Schober
伊尔梅瑙工业大学，微纳米技术研究所，德国伊尔梅瑙
Vladimir Polyakov
弗劳恩霍夫应用固体物理研究所，德国弗莱堡
Vadim Lebedev
弗劳恩霍夫应用固体物理研究所，德国弗莱堡
Volker Cimalla
弗劳恩霍夫应用固体物理研究所，德国弗莱堡
1.1 引言
哺乳动物的神经细胞是所有生物体中*精密、*复杂的信号传递和处理系统之一。许多疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病或肌萎缩侧索硬化，成因都是神经细胞的紊乱。研究神经细胞在神经抑制剂或镇痛剂等应激物诱导下发生生理变化的机制，是了解此类神经疾病信息的一种方法，并为开发治疗方案开辟了道路。然而，开发有效治疗这类疾病的新药是一个漫长的过程，其**步往往是研发一种新的酶抑制剂。过去，识别这种新型抑制剂的唯一方法是遵循“试错”原则：针对目标酶筛选庞大的化合物库，并研究其反应以获取有效信息。这种“蛮力”方法在某种程度上是可行的，甚至扩展了组合化学方法和高通量筛选技术，以快速生产大量新型化合物、筛选庞大化合物库中的有用抑制剂。然而，尽管在环境保护、毒理学和药物开发领域对高通量功能筛选方法的需求不断增加[1-5]，但这些方法在细胞测量方面还不够有效[3，5，6]。
在药理学中，研究特定化合物的副作用是很重要的。因此，有必要在整个有机体层面应用复杂的功能测试[7，8]。要评估可能成为药物的化学物质的整体毒性，使用生物传感器对功能细胞进行研究可能比纯物理化学方法更有效[9]。近年来，全细胞生物传感器在毒素检测、药物筛选和细胞动作电位记录方面的应用，已经从学术原理发展为一种被广泛接受的方法[9-19]。早在20世纪50年代初，Hodgkin和Huxley就通过精心设计玻璃微电极刺入细胞膜来研究单个细胞的电学特性，通过这种方法记录了神经元细胞的动作电位，并证明了电压门控离子沟道的存在[20]。20多年后(1976年)，Neher和Sakmann进一步改进了这种方法，开发了膜片钳技术[21]。实验中，玻璃电极被放置在靠近细胞膜的地方，与细胞内部建立低阻抗电接触[22]。利用这种全细胞结构，可以研究细胞膜上的电压门控离子沟道组合，甚至细胞膜上单个离子沟道的功能。然而，这种在医学、药学和生理学研究中被广泛接受的新方法也有一些缺点。膜片钳法操作复杂，具有侵入性，而且在测量后会破坏细胞。此外，这种方法仅限于同时观察几个细胞。同时因为在膜片钳测量期间，细胞会受到很大的应力，因此不能进行长达几个小时的观察。
在开发膜片钳系统的同时，1972年，Thomas等[23]设计了一种平面微电极阵列，用于记录体外培养细胞的胞外电活性；在图案光阻钝化的玻璃基板上构建已知间距和尺寸的镀金镍电极；一个玻璃环用蜡固定在基板上，形成一个培养室。许多研究人员对Thomas等的技术稍加改进，利用微电极阵列在不同条件下检测了多种类型的细胞。在这种模式下，1977年，Gross等[24]*次记录了外植神经组织的胞外电反应。仅仅几年后(1980年)，Pine提议将已开发的两种方法相结合：将玻璃微管插入细胞膜和微电极阵列，以便同时记录细胞内和细胞外的信号[25]。这是一个重要的同步实验，既验证了细胞外技术，又校准了记录的细胞外信号，以便与文献中关于细胞内记录的大量数据进行比较。Pine*次用SiO2取代有机光刻胶钝化层，以便使用标准的硅芯片加工技术。基于前文提到的结构和技术，多年来，许多科研小组持续对培养细胞及多类型细胞进行研究[26-30]。
1991年，Fromherz等[12]利用集成场效应晶体管(FET)代替以前使用的裸金属电极作为传感元件，开创了生物传感的新纪元。人工将单个离体细胞置于晶体管上以记录胞外信号。将玻璃微管插入细胞膜，用于刺激细胞和监测细胞内电压。后来，Fromherz等使用类似的系统，利用放置在神经元下方的晶体管阵列[31]以及通过薄氧化层对神经元的电容刺激，探索了神经元-硅交界处的物理特性[32]。
基本的传感元件是由Bergveld于1970年[33]提出的pH敏感场效应晶体管，由此引发了大量有关基于成熟硅技术的离子敏感场效应晶体管(ISFET)研究刊物的出版。Bergveld[34]对其发展历程进行了概述，强调其未来的挑战和机遇。硅基生物传感ISFET(BioFET)的进一步分类如图1.1所示。
尽管这些基于硅技术的器件前景广阔、实验效果显著、有利于大规模生产，但是损害了器件的长期化学稳定性，从而限制了实际应用[37]。因此，研究人员致力于开发新的功能性和钝化表面层，但尚未取得令人满意的结果，也未将BioFET应用于商业器件。
21世纪初，一种基于Ⅲ族氮化物(GaN、AlN及合金)的新型ISFET被报道。与Si或传统的Ⅲ-Ⅴ族半导体相比，Ⅲ族氮化物表现出许多优越的性能，因此很有希望成为生物传感器的候选材料[38-40]。2003年，Steinhoff等*次报道了这些ISFET在pH传感中的应用[41]。两年后，同一作者报道了使用传感器阵列记录心肌细胞动作电位的情况，与基于硅技术的类似器件相比，基于Ⅲ族氮化物的ISFET具有更优越的电气特性[19]。
在未来的应用中，对所记录信号的基本理解仍然是至关重要的前提条件。在本研究中，基于AlGaN/GaN异质结构的ISFET进一步表征了其与神经细胞的耦合，以便能够应用于CPFET。具体来说，本章分为以下主题。
评估生物相容性和典型的设备处理步骤对活细胞反应的影响。
采用神经母细胞瘤-神经胶质瘤混合NG108-15神经细胞系作为细胞外传感器的细胞系统。
研究神经细胞与场效应晶体管混合系统的适用性和可靠性。
本章工作的内容如下：1.2节简要介绍使用基于AlGaN的场效应晶体管的传感器；1.3节概述制造步骤以及ISFET的基本电气特性，其中特别关注了传感器的稳定性和生物相容性；1.4节描述细胞-晶体管耦合实验的实验条件，包括所使用的细胞系和神经毒素的剂量；1.5节总结校准实验以确定不同离子的灵敏度；基于这些*次耦合实验，1.6节介绍在药物筛选方面对NG108-15神经细胞-场效应晶体管传感器混合系统的反应进行监测的情况；*后，1.7节利用位点结合模型对异质结构进行自洽模拟，并根据测得的信号变化估算神经细胞与场效应晶体管传感器之间的离子通量，从而对前文的结果进行分析。
1.2 AlGaN场效应传感器
光电器件和高频晶体管是Ⅲ族氮化物半导体中*受关注和广泛研究的应用领域之一。特别是限制在AlGaN/GaN异质结构中的二维电子气(2DEG)已在制造高电子迁移率晶体管(HEMT)方面取得了极具前景的成果，并可应用于高频功率放大器[42]。同时，Ⅲ族氮化物基微结构及纳米结构的光学特性和电子特性已被证明对表面电荷极为敏感。例如，将未钝化的AlGaN/GaNHEMT暴露在水蒸气中会导致极化诱导的2DEG显著衰减，导致电子器件特性发生劣化。从HEMT器件研究中获益并利用基本HEMT结构开发出的气体和液体化学传感器，在过去几年中受到越来越多的关注(详情见Eickhoff等[39]和Pearton等[40]的综述)。由于具有宽禁带和较强的键合强度，该材料体系具有非常好的化学稳定性，这体现在它们对湿法刻蚀的耐受性[43，44]和生物相容性[45，46]。Ⅲ族氮化物具有宽禁带[19]的低噪声和对表面电荷[38]变化的高灵敏度，因此被认为是*有前途的生物传感器的制备材料之一[47]。此外，在光谱的可见光部分具有光学透明性，为标准光学和电子测量的结合提供了可能。在集成设备的构建方面，可以将化学传感器与Ⅲ族氮化物光电元件(用于光谱分析)、晶体管(用于片上信号处理)和表面声波器件[48](用于模拟信号滤波)进行单片集成。此外，无线传感器网络也被用于射频识别(RFID)技术[40]。
在传统的HEMT中，2DEG在漏极(D)和源极(S)欧姆接触点之间形成沟道，并由栅极进行调制。在一个未覆盖的栅极上，表面电势和2DEG密度会受到环境中带电物质的影响。对电荷的强响应*初称为寄生效应，必须加以控制以优化HEMT，但其在传感器应用的潜力就得到了证实，并代表了实现ISFET的基本理念。AlGaN/GaN场效应晶体管在电解液中的这些特性对于其作为生物传感器至关重要。
与基于Si的传统ISFET相比，AlGaN/GaN异质结构利用了材料系统[49，50]的压电和自发极化特性。因此，AlGaN/GaN异质结构非常简单，无需额外的钝化膜或精心设计，同时保留甚至超过硅基ISFET的灵敏度、噪声特性、化学和热稳定性。通过省略栅极金属化而留下裸GaN表面，Neuberger等[38]*先观察到离子对沟道电流ID的调制；离子由等离子体发射装置产生，并被引向表面；入射离子导致的表面电荷变化直接影响了2DEG的密度。将水和不同的有机溶剂应用于相同结构的表面，表明ID受液体[51]中分子的偶极矩的影响。
AlGaN/GaN电解液栅极场效应晶体管(EGFET)是ISFET的一种特殊结构，其开放的栅极区域直接暴露在电解液中。该EGFET是所有基于AlGaN/GaN的生物传感器的基本元件。与固定的栅极电压不同，参考电势Uref通过浸入电解液中的参比电极，施加到电解液-氧化物-半导体系统[52](图1.2)。
正漏极电压UDS驱动AlGaN-GaN接口平行的漏极电流ID。额外施加的基准电压Uref会使费米级相对于未掺杂GaN层的导带发生移动，促使晶体管工作。由于开路栅极表面的电荷(AlGaN层中的施主未被占据)，大部分电压都跨过了AlGaN层，从而在开路栅极和2DEG之间建立了一个准绝缘势垒。根据参考电压的不同，界面上的三角势阱的能量升高或降低，沟道被清空或填满。这对应于漏源电流的变化。对于足够大的基准偏压，在阈值电压UT下，2DEG区域完全耗尽，电流沟道被切断。非饱和区域(低于截断范围)的漏电流为
(1.1)
其中，β取决于几何形状的参数(沟道宽长比W/L)，是2DEG中电子的迁移率，以及Cox是单位面积的栅绝缘体电容：
(1.2)
就ISFET而言，栅极电压是参考电极处的电压，Uref=UGS。阈值电压还包含了反映以下界面特性的项：一侧液体和栅极氧化物之间的界面特性，以及另一侧液体和参比电极之间的界面特性。在传统的金属-氧化物-半导体场效应晶体管(MOSFET)中，栅极金属的功函数被相对于真空的参比电极电势Eref所取代。真空能级可以用相对于正常氢电极(NHE)的电势加上相对于真空状态的费米能级值(UNHE=4.7V[53])来计算。对于广泛使用的Ag/AgCl电极，计算得出Uref=4.9V。栅氧化物-电解液界面的界面电势由溶液的表面偶极电势Xsol和表面电势0决定，前者是一个常数，后者是化学反应的结果，通常由氧化物表面基团的解离决定。在这种情况下，阈值电压的计算公式为
(1.3)
其中，QB是AlGaN中的耗尽电荷；ΦF是费米势；AlGaN是材料功函数；QSS是GaN表面的表面态电荷；Qox是固定的氧化物电荷。
除0外，所有项都是常数，0决定了ISFET对离子的敏感性。离子浓度对0的影响可以用Yates等[54]在1974年提出的位点结合模型来解释。该模型认为，金属和半导体氧化物表层的原子在与电解液接触时起到两性的作用。这意味着，根据电解液中的H+(OH)浓度的不同，它们可以向电解
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