**章绪论
**节 流式细胞术的发展历史及现代应用
一、流式细胞术
流式细胞术（flow cytometry，FCM）源自国外，“cytometry”中“cyto=cell”，即细胞，“metry=measurement”，即检测，因此其创始初衷是检测液流中单个细胞的特征，这些特征由早期的细胞数量、细胞大小和颗粒程度扩展到如今的多种细胞膜、细胞内蛋白抗原表达等多细胞参数。*早期的流式细胞仪仅能检测1～2个参数，然而现在的流式细胞仪常规可同时检测20多个参数，并且具备每秒分析上万个细胞的速度。更为重要的是，流式细胞术的发展不仅包括具有强大的分析细胞特征能力的流式细胞仪，同时也包括兼具分析和特定细胞群体分选能力的流式细胞分选仪[又称荧光激活细胞分选仪（.uorescence activated cell sorter，FACS）]。因此，流式细胞术已成为现代细胞生物学研究及临床检测领域不可或缺的工具。
二、流式细胞术与流式细胞分选仪的诞生及发展
（一）流式细胞术的诞生
流式细胞术经历了数十年的发展，现今的仪器仍沿用早期流式细胞仪的核心原理。流式细胞仪涉及的激光学、抗体和抗体标记技术及电子学等经历了多年的快速发展，目前15通道以上的流式细胞仪在大多数实验室并不少见，正有力地推动着科学研究前进，流式细胞术为生命科学研究带来了一次深刻的技术革命。
1934年，Moldavan*次报道“在液流中自动计数细胞”。它是如何实现的呢？使红细胞悬液流过被置于显微镜平台上的毛细管，每当红细胞通过安装在光学镜片上的光电元件时，就会被记录，从而达到自动计数的目的。1949年Coulter（库尔特）提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利，这也是“库尔特计数器”的前身。库尔特计数器由每个细胞通过特定的狭窄通道时产生的信息来精确计数悬液中的颗粒（如红细胞），即有无颗粒通过时都会产生一个可检测的电子学特征的变化，并且库尔特计数器可以确定颗粒或细胞的相对大小。现今许多血液学仪器仍沿用“库尔特原理”。
1953年，Crosland-Taylor利用层流的原理（靠近固相边界鞘液包裹着未间断的样品流，两种液体同轴流动，使位于中心的样品流沿着一个方向稳定地流动，液流的方向在每个点上保持连续）设计了光学计数红细胞的流动室。单个红细胞悬液被缓慢地注射至流速较快的液流中。在外层液流的约束下，红细胞在样品流中排成单列。这一设计的成功使得更大直径的通道被使用，以及狭窄的中心样品（颗粒）流可以被检测。这个流体动力学的核心技术几乎被现在所有的流式细胞仪所应用。
流式细胞术原理建立前，细胞分选是根据1879年Lord Rayleigh所观察到的液滴形成的物理学现象提出的。Lord Rayleigh发现通过小孔的液流表现出流体动力学不稳定现象，并且通过分裂成一系列液滴来降低其表面张力，这些液滴整体上具有更小的表面积，因此也具备更小的表面张力。如果没有外力作用于液流，液滴的形成模式是不可预测的。
喷墨打印技术的发明，使得这个液滴形成现象变得精准而稳定。1965年Richard Sweet将Lord Rayleigh研究的原理应用于喷墨打印。Sweet描述了一个这样的喷墨打印系统：墨汁被带上静电荷并且依照输入电压信号做出相应的偏斜而完成打印，“墨汁流”被分成有规律的均匀液滴并且这些液滴所带的电荷能被输入系统所控制。
同年，在美国洛斯阿拉莫斯Marvin Van Dilla的实验室工作的Mack Fulwyler正在监测大气层核武器爆炸试验的“放射性坠尘”是否会出现在肉、牛奶等食品中。Fulwyler决定通过分离全血中这两种分布模式不同的红细胞亚群来完成这项任务，并想应用库尔特原理及机械瓣膜来将红细胞亚群进行物理分离。意识到这种方式的可行性不高，Fulwyler在寻求其他办法时正好读到Sweet喷墨打印机的研究论文，这给了Fulwyler很大的启发，于是Fulwyler将Sweet的喷墨静电液滴偏转原理应用于库尔特细胞捕获仪。细胞通过库尔特小孔时被检测，同时液流分裂成包裹细胞的液滴。这些液滴可以带上电荷，在通过带有高电压的两个电极板时可偏转到所选的收集管中，该成果发表于《科学》（Science）杂志。因此，**台细胞分选仪（根据细胞体积）诞生于1965年。
同一时期，遗传学家及免疫学家Len Herzenberg正在花费大量时间在黑暗的房间里计数免疫荧光染色的细胞。在发现单克隆抗体期间，他感受到分离细胞将对细胞生物学研究有极大的帮助。同时在Fulwyler细胞分选仪的启发下，Herzenberg在斯坦福大学快速组建了一支优秀的工程师团队来仿制Fulwyler细胞分选仪，并且做了重大改进：增加了光源——汞弧灯，以及光电倍增管检测器。这个重大创新使得分选仪不仅可根据细胞体积特征计数，而且可以根据荧光偶联抗体标记的细胞发射荧光信号（细胞抗原）计数，荧光激活细胞分选仪（FACS）由此诞生。
（二）流式细胞术的发展
Herzenberg团队研发的机器随后由Becton Dickinson（BD）公司商业化生产，并推出了FACS-1。实际上，BD公司现在仍拥有商标FACS。FACS-1可以测量前向散射光和波长530nm以上的荧光，并且具有数据脉冲计数器，以记录检测的细胞总数及分选的细胞数。在接下来的几年中，几家公司生产了商业化的细胞分选仪和分析仪。自从*台流式细胞仪商业化，流式细胞术就进入了跨越式发展的阶段。
19世纪70～80年代末，生物医学研究者们开始制造抗白细胞的单克隆抗体，并用荧光染料标记这些抗体。随着抗体和荧光染料数量的增加，流式细胞仪上的激光数量也在增加。流式细胞学家Howard Shapiro研制出了自己的细胞仪，并且在机器上增加了多个激光器和检测器。流式细胞仪逐渐演变为今天在实验室中所使用的样子。到1990年，流式细胞仪能够同时检测7种荧光。2000年，BD公司推出了具有14色功能的LSRⅡTM。如今一些流式细胞仪能够检测多达32个参数，更多检测通量的质谱流式技术诞生，其能够以每秒检测成千上万颗粒的速度运行，使研究者能够更加便捷地进行生命科学研究及临床疾病诊断。这一惊人的技术及其功能应归功于物理学家、生物物理学家、生物学家和计算机工程师。
三、现代流式细胞术在科学研究及临床中的应用
现代流式细胞术应用十分广泛，国内一般的科研院所及三级甲等医院都常规配备流式细胞分析仪或分选仪。分析仪主要由液流系统、激光系统、信号检测及输出系统、控制系统等组成，分选仪则在分析仪的基础上添加了液流偏转分选系统。
流式细胞术的迅猛发展对生物医学产生了重大影响，同时在临床疾病诊断中发挥了重要的作用，尤其在血液疾病的诊断分型及预后监测中发挥了重要的作用。
第二节 流式细胞术实验任务与设计
一、流式细胞术可完成的实验任务
（一）广泛的细胞生物学特征分析能力
流式细胞术分析的对象主要是细胞。通过联合荧光抗体，流式细胞术可以在单细胞水平检测多种多样的抗原表达，进而可以为不同样本来源的多种细胞群体提供丰富的生物学信息。这些抗原可以分布在细胞膜、细胞质及细胞核。除了获取特定细胞亚群多种蛋白抗原的表达信息外，还可以根据蛋白表达来获取它们的各种细胞生物学信息，其中包括细胞亚群的组成，细胞的死活、凋亡、增殖，转录因子的表达，吞噬作用，细胞毒性，活性氧的产生，细胞代谢状态及特定信号通路状态的检测等，并且相互之间可以进行个性化的组合。下面通过举例的方式来介绍流式细胞术常用的几种分析功能。
1.细胞亚群的组成
随着生物学研究的发展，对于机体细胞组成的认知越来越深入。流式细胞术可以根据不同细胞群体的特征标志蛋白的表达差异，直观地呈现目标细胞亚群的组成，以及在不同条件下亚群组成的变化。例如，通过流式细胞术解析小鼠造血细胞和淋巴细胞亚群。
如图1-1所示，小鼠造血细胞包括造血干/祖细胞、髓系血细胞和淋系血细胞等。根据免疫细胞表型，可以通过流式细胞术进行细胞分析和分选。小鼠造血干/祖细胞（HSC/HPC和MPP）和髓系定向祖细胞表面标志物B220、CD3、CD11b、CD19、Gr-1、Ter119表达为阴性，c-Kit表达为阳性。造血干祖细胞（HSPC）（Sca-1+）通过CD48、CD150可进一步分为造血干细胞（HSC）、造血祖细胞1（HPC1）、造血祖细胞2（HPC2）和多能祖细胞（MPP）各群。定向造血祖细胞（HPC）（Sca-1-）通过CD34、CD16/32分为髓系共同祖细胞（CMP）、粒-单核祖细胞（GMP）和巨核-红系祖细胞（MEP）各群。红细胞、粒细胞、单核细胞等髓系成熟血细胞分别表达特异性标志物Ter119、CD71、Mac-1、Gr-1和CD115。淋系定向祖细胞表面标志物B220、CD3、CD11b、CD19、Gr-1、Ter119表达为阴性，IL-7R表达为阳性，c-Kit/Sca-1表达为弱阳性。淋系成熟血细胞B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞分别表达特异性标志物CD19、B220、CD4和CD8。
图1-1 流式细胞术分析小鼠造血细胞及其亚群组成
Lin：lineage，谱系标志；DAPI：4′6-二脒基-2-苯基吲哚；LKS：Linc-KitSca-1；LSC：白血病干细胞
如图1-2所示，小鼠淋巴细胞包括B、T和NK细胞（图1-2A），其中B细胞包括祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞等亚群（图1-2B），CD4+T细胞包括记忆CD4+T细胞、初始CD4+T细胞和自然调节T细胞（nTreg细胞）等亚群（图1-2C），CD8+T细胞包括效应型记忆CD8+T细胞、中央型记忆CD8+T细胞和效应CD8+T细胞等亚群（图1-2D）。此外，流式细胞的生物信息学高级分析可以更好地展示不同细胞群体的表型特征（图1-3、图1-4）。
为了研究造血细胞的分化群体特征与线粒体功能的关系，t分布随机邻域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding，tSNE）和流式自组织特征映射（.ow self-organizing featuremap，FlowSOM）可用于表征不同分化阶段的造血细胞的群体特征。tSNE分析可以识别高维度的蛋白标志物关联性，将细胞的高维相似性可视化，提供一种流式细胞群体数据分析的新方法。tSNE分析结果反映了HSPC群组中HSC、HPC1、HPC2和MPP，以及定向HPC群组中CMP、GMP和MEP的抗原表达分布情况（图1-3），与**的流式二维逐级圈门所得的细胞群比例相符。
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