1 绪论
1.1 酵母概述
1.1.1 酵母中乙酰辅酶A的代谢
1.1.2 酵母中的rDNA簇
1.2 CRISPR-Cas系统及其介导的基因组编辑技术
1.2.1 CRISPR-Cas系统概述
1.2.2 CRISPR-Cas系统的种类和特征
1.2.3 CRISPR-Cas系统介导的基因组编辑技术
1.3 汉逊酵母及其遗传操作的研究现状
1.3.1 PCR产物介导的一步法基因敲除技术
1.3.2 Cre-loxP系统介导的无标记基因修饰系统
1.3.3 mazF基因介导的反筛系统
1.3.4 CRISPR-Cas9系统介导的基因组编辑技术
1.4 白藜芦醇及其生物合成的研究现状
1.5 人血清白蛋白和戊二胺概述
1.5.1 人血清白蛋白
1.5.2 戊二胺
1.6 生物柴油及其生物合成的研究现状
1.7 研究目的、意义、内容和技术路线
1.7.1 研究目的及意义
1.7.2 研究内容
1.7.3 技术路线
2 基因组编辑技术在汉逊酵母中的建立
2.1 引言
2.2 实验材料与设备
2.2.1 实验材料
2.2.2 培养基及生物化学试剂的制备
2.2.3 仪器和设备
2.3 实验方法
2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的化学转化
2.3.3 大肠杆菌的质粒提取
2.3.4 大肠杆菌基因组DNA的提取
2.3.5 DNA的纯化和回收
2.3.6 载体的构建
2.3.7 真菌基因组DNA的提取
2.3.8 汉逊酵母感受态细胞的制备
2.3.9 汉逊酵母感受态细胞的转化
2.4 结果与分析
2.4.1 表达组成型Cas9蛋白线性化载体的获得
2.4.2 转录gRNA线性化载体的获得
2.4.3 汉逊酵母中CRISPR-Cas9系统介导的无痕基因编辑流程
3 汉逊酵母中的单位点基因组编辑
3.1 引言
3.2 实验材料与设备
3.2.1 实验材料
3.2.2 培养基及生物化学试剂的制备
3.2.3 仪器和设备
3.3 实验方法
3.3.1 流式细胞仪检测
3.3.2 其他实验方法
3.4 结果与分析
3.4.1 OpLEU2基因的敲除
3.4.2 OpURA3基因的敲除
3.4.3 OpURA3基因的精确点突变
3.4.4 gfpmut3a基因在OpLEU2基因位点的整合
3.4.5 gfpmut3a基因在OpURA3基因位点的整合
3.4.6 gfpmut3a基因在OpHIS3基因位点的整合
4 酵母中的多位点基因组编辑
4.1 引言
4.2 实验材料与设备
4.2.1 实验材料
4.2.2 培养基及生物化学试剂的制备
4.2.3 仪器和设备
4.3 实验方法
4.3.1 流式细胞仪检测
4.3.2 实时荧光定量PCR检测
4.3.3 HPLC检测
4.3.4 其他实验方法
4.4 结果与分析
4.4.1 OpLEU2、OpURA3和OpHIS3基因的同时敲除
4.4.2 CRISPR-Cas9系统在汉逊酵母中介导的多位点整合
4.4.3 CRISPR-Cas9系统在汉逊酵母中介导的多拷贝整合
4.4.4 融合表达盒在OprDNA位点的多拷贝整合
4.4.5 cadA基因在OprDNA处的多拷贝整合
4.4.6 HSA基因在OprDNA位点的多拷贝整合
4.4.7 多拷贝整合方法在酿酒酵母的建立
5 汉逊酵母中游离质粒的构建及应用
5.1 引言
5.2 实验材料与设备
5.2.1 实验材料
5.2.2 培养基及生物化学试剂的制备
5.2.3 仪器和设备
5.3 实验方法
5.4 结果与分析
5.4.1 汉逊酵母中游离质粒的构建
5.4.2 gfpmut3a基因在游离质粒上的表达
5.4.3 汉逊酵母中游离质粒的消除
6 利用基因编辑技术在酿酒酵母中建立生物柴油合成途径
6.1 引言
6.2 实验材料与设备
6.2.1 实验材料
6.2.2 培养基及生物化学试剂的制备
6.2.3 仪器和设备
6.3 实验方法
6.3.1 酿酒酵母感受态细胞的制备
6.3.2 酿酒酵母感受态细胞的转化
6.3.3 基因编辑
6.3.4 摇瓶发酵
6.3.5 SAM的提取与检测
6.3.6 脂肪酸和脂肪酸甲酯的提取
6.3.7 游离脂肪酸和生物柴油的检测
6.4 结果与分析
6.4.1 外源基因在酿酒酵母中的功能验证
6.4.2 增强游离脂肪酸供给的效果评价
6.4.3 增强甲基供体SAM供给的效果评价
6.4.4 基因工程菌的发酵验证
6.4.5 基因工程菌的发酵罐实验
7 总结与展望
7.1 Cas9蛋白和gRNA在染色体上的表达
7.2 CRISPR-Cas9系统介导的基因组编辑技术的效率
7.3 CRISPR-Cas9系统介导的点突变的精确性
7.4 汉逊酵母中无痕多位点编辑技术的首次建立
7.5 多拷贝整合方法的实用性和应用性
7.6 结论
7.7 创新点
7.8 展望
参考文献
附录
附录1 本书2～6章所使用的菌株、质粒和引物
附录2 CRISPR-Cas9系统及白藜芦醇生物合成相关基因序列及启动子序列
附录3 CRISRP-Cas9系统介导的基因组编辑技术在汉逊酵母中的编辑效率
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