《分子微生物学实验指南》是一部系统梳理与深入探讨现代微生物学实验方法的综合性指导书。《分子微生物学实验指南》围绕微生物学研究的**领域、新兴方向、多学科交叉应用、高通量与精准基因编辑技术四大模块展开，为科研工作者提供了详尽的实验技术解析与应用示范。
　　　　在**微生物系统部分，《分子微生物学实验指南》深入剖析了细菌趋化、群体感应信号调控、六型分泌系统及毒素-抗毒素系统等核心领域，重点介绍功能鉴定与机制解析的实验设计与操作细节。在新兴衍生微生物方向，《分子微生物学实验指南》着眼于微生物学前沿课题，从细菌生物被膜的构建与研究，到耐药性持留菌形成机制及生态位竞争研究，再到生防菌的应用开发，提供了从基础实验到研究应用的完整技术路径。在交叉领域中，《分子微生物学实验指南》结合光遗传学、类器官模型与免疫学技术，详细讲解了光控元件调控细菌行为、病毒-宿主互作机制及抗病毒单克隆抗体筛选的*新进展，为探索复杂微生物系统提供创新思路。在高通量与精准基因编辑技术部分，《分子微生物学实验指南》聚焦于备受关注的CRISPR基因编辑、转座子高通量筛选、基因组等位基因标记等尖端技术，解析其在微生物功能基因组学与感染机制动态研究中的广泛应用。

**章**微生物系统实验技术
　　**节细菌趋化行为的观测及趋化系统信号转导蛋白的鉴定方法
　　莫然，高贝乐
　　中国科学院南海海洋研究所
　　摘要：细菌的趋化运动是指细菌对于周围环境中化学物质浓度梯度的感知和定向运动。这种行为对于细菌的生存至关重要，使其在寻找营养物质、避开有毒物质或寻找合适的生长环境时做出正确的决策。细菌的趋化行为主要通过两种机制实现：一种是趋化信号转导通路，另一种是利用鞭毛的旋转来改变细菌的游动方向。化学感受蛋白通过感知环境中特定化合物的浓度梯度，引发趋化系统的磷酸信号级联反应，特定的反应调节蛋白接收该信号后，控制鞭毛马达的旋转方向，*终使细菌朝向营养物质浓度较高的方向游动。研究细菌趋化行为的方法主要包括直接观察和分析菌体趋化行为、分析趋化通路和相关蛋白的功能。直接观察和分析菌体趋化行为的方法包括毛细管趋化实验、试管软琼脂趋化实验、显微镜单细胞运动轨迹追踪等。分析趋化通路和相关蛋白的方法主要包括基因敲除、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质的体内和体外鱗酸化试验。本章以空肠弯*菌（Campylobacter jejuni）81-176为实验对象，提供了一套检测细菌趋化行为的方案，以及从遗传、生化和亚细胞定位三个方面研究趋化系统信号转导蛋白功能的方法。通过这些方法可以深入研究趋化通路中各个环节的作用、趋化系统中各蛋白质之间的关系，以及信号级联反应的机制，从而深入了解趋化系统信号通路的分子机制。总之，细菌趋化行为的研究是一个复杂而又多样化的领域，综合运用多种方法和技术手段有助于更深入地探究细菌趋化行为的分子机制。
　　关键词：空肠弯*菌，趋化行为，趋化系统信号转导
　　一、背景
　　细菌的趋化行为是指具有运动能力的细菌在环境中表现出一种“趋利避害”的行为，这种行为由多种蛋白质组成的趋化系统控制[1]。许多致病性细菌依靠趋化作用和运动能力来入侵其宿主，空肠弯*菌（Campylobacter jejuni））和幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）等肠道细菌的趋化行为能帮助菌体向胃肠道中有利的环境移动，例如，幽门螺杆菌在胃的内壁上定植，对胃黏蛋白有趋化行为[2]。
　　趋化系统是所有信号转导系统中*为复杂的系统，由多个蛋白质在细菌内膜或者细胞质内形成阵列，从而进行信号的感知和响应。过去对大肠杆菌（Escherichia coli）的大量研究揭示了**趋化系统的作用模式[1]:细菌利用多种跨膜的化学感受器（chemoreceptor）测量细胞附近化学物质的浓度，这些信号输入蛋白通过偶联蛋白CheW作用于组氨酸激酶CheA，CheA利用磷酸基团供体ATP将应答蛋白CheY磷酸化。其中，CheY的磷酸化状态决定了细菌鞭毛的运动方向。对细菌生长有利的化合物结合在跨膜化学感受蛋白上时，CheA激酶的活性受到抑制，导致非磷酸化的CheY蛋白比例增加，此时非磷酸化的CheY不能与鞭毛的马达蛋白FUM相互作用，因此鞭毛呈逆时针方向旋转，此时细菌保持直线游动不转向;相反的，当有利于细菌生长的化合物匮乏时，CheA激酶磷酸化CheY，磷酸化后的CheY作用于鞭毛马达蛋白FUM，此时鞭毛顺时针转动，通过菌体反转或倒退而改变运动方向。除了这些核心趋化蛋白外，E.co/i和许多其他细菌中还存在能够对跨膜化学感受蛋白进行甲基化与去甲基化修饰的CheR与CheB蛋白，以及将CheY蛋白去磷酸化的磷酸酶CheZ，共同调控信号转导过程。
　　以上介绍的E.co/i的趋化信号转导通路是我们理解细菌趋化的基础，然而近二十年来对不同种类细菌趋化系统的功能研究揭示了它们区别于**趋化信号转导模式的作用机制。枯草芽孢杆菌iBaciUussubti/is）的趋化系统控制鞭毛转向的方式与E.co/i的作用机制相反，环境中的引诱剂结合化学感受蛋白而增强CheA的活性，迅速导致CheY的磷酸化，磷酸化的CheY与鞭毛马达蛋白结合，使鞭毛逆时针方向旋转，细菌呈直线游动；而E.co/i磷酸化的CheY会导致鞭毛马达顺时针方向旋转，细菌进行翻滚和转向运动[3]。
　　不同种类的细菌所编码的趋化蛋白具有多样性，而且许多细菌的基因组编码了多个趋化系统，可能形成一个以上的趋化蛋白阵列进行信号传递。例如，霍乱弧菌（Vibriocho/erae）具有3个编码趋化基因的操纵子，这三个操纵子编码了三个完整的趋化蛋白阵列，其中一套趋化蛋白阵列对鞭毛运动起主要调控作用[4]。研究人员根据基因排布顺序、蛋白质成分、化学感受蛋白类型，将趋化系统划分为19个类别，包括1个控制IV型菌毛的趋化系统（Tfp）、1个“类趋化功能”系统（ACF），以及17个控制鞭毛的趋化系统（F1～F17）[5]。该分类体系为研究有多套趋化系统的细菌信号转导机制及趋化系统的进化提供了重要依据。因此，在对研究对象进行趋化行为的实验分析之前，可参考该趋化类别的分类方法，对研究对象基因组中的趋化基因进行调查，有助于后续趋化实验的设计和实施。
　　本章以空肠弯*菌为实验对象，*先介绍该菌的趋化行为分析方法，然后介绍趋化蛋白参与信号转导通路的研究方法。细菌趋化行为的检测主要利用化学物质梯度等外部刺激来诱导和检测。趋化蛋白参与信号转导通路的研究方法主要包括以下两种：①遗传学方法，包括基因敲除和表达调控等方法，可以通过改变某些基因的表达或功能来研究趋化通路的作用和机制；②生物化学检测方法，包括荧光标签、蛋白质相互作用和蛋白磷酸化测定等方法，可深入了解趋化信号通路中各个蛋白质的功能并揭示其分子机制。
　　总之，细菌趋化运动和信号通路的检测方法需要综合运用多种技术手段，以便更深入地了解细菌趋化行为的本质。这些方法不仅可以为研究细菌行为提供有力依据，也在抗生素的开发、细菌感染的治疗等领域具有重要意义。
　　二、材料与试剂1.培养基
　　（1）LB培养基（高盐）：
　　①液体培养液：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，调节pH至7.0，分装后高压灭菌。
　　②固体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和15g琼脂粉，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，调节pH至7.0，分装后高压灭菌。
　　（2）胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基：胰蛋白胨大豆琼脂粉400g，蒸馏水定容至1000mL，分装后高压灭菌。
　　（3）布氏肉汤（Brucella broth）培养基：称取28g布氏肉汤粉、15g琼脂粉，加蒸馏水定容至1000mL，分装后高压灭菌。
　　（4）脑心浸（brainheart infusion，BHI）培养基：称取脑心浸粉3.7g，加蒸馏水定容至100mL，高压灭菌后备用。
　　若需要向固体培养基中加入抗生素，则在培养基灭菌后，冷却至50°C左右时加入，充分混匀后倒固体平板。注意事项：①抗生素不耐高温，避免高压灭菌；②不同抗生素用不同溶剂稀释；③现用现配，工作浓度下易分解失效，配制母液后一般冻存于-20C低温冰箱。
　　2.试剂
　　（1）磷酸缓冲盐溶液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HP〇41.42g、KH2PO40.27g，用浓盐酸将pH调至7.4，蒸馏水定容至1000mL。
　　（2）Tris缓冲盐溶液：NaCl8.8g、1mol/LTris-HCl（pH8.0）2mL，蒸馏水定容至1000mL。
　　（3）50xTAE缓冲液：Tris242g、乙二胺四乙酸二钠二水合物37.2g、乙酸57.1mL，蒸馏水定容至1000mL。
　　（4）5xTris-甘氨酸缓冲液：Tris15.1g、甘氨酸94g、十二烷基硫酸钠5g，蒸馏水定容至1000mL。
　　（5）5xSDS-PAGE蛋白上样缓冲液：1mol/LTris-HCl（pH6.8）1.25mL，十二烷基硫酸钠0.5g、溴酚蓝25mg、2-巯基乙醇25吣、甘油2.5mL，蒸馏水定容至5mL。
　　（6）SDS-PAGE胶：①分离胶（10%）:ddH2O4.27mL、1.5mol/LTris-HClpH8.8）2.625mL、10%（w/F）十二烷基硫酸钠105^L、30%（w/F）聚丙烯酰胺3.5mL、10%（w/F）过硫酸铵70士、四甲基乙二胺7吣；②浓缩胶（10%）：ddH2O3.075mL、0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）2.625mL、10%（w/FO十二烷基硫酸钠105L、30%（w/F）聚丙烯酰胺3.5mL、10%（w/F）过硫酸铵70吣、四甲基乙二胺7吣。
　　（7）考马斯亮蓝G-250缓冲液：考马斯亮蓝G-2501g、异丙醇250mL、冰乙酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。
　　（8）考马斯亮蓝染色脱色液：冰乙酸100mL、乙醇50mL，蒸馏水定容至1000mL。
　　（9）膜转移缓冲液（用于免疫印迹法）：甘氨酸2.9g、Tris5.8g、十二烷基硫酸钠0.37g，蒸馏水加至800mL，加入甲醇200mL。
　　（10）TBST缓冲液（用于免疫印迹法）NaCl8.8g、1mol/LTris-HCl（pH8.0）20mL、吐温-200.5mL，蒸馏水定容至1000mL。
　　（11）封闭缓冲液（用于免疫印迹法）：脱脂奶粉5g、TBST缓冲液100mL。
　　（12）抗生素母液：氨苄青霉素100mg/mL、卡那霉素50mg/mL、氯霉素30mg/mL；安普霉素50mg/mL。
　　（13）试剂盒：快速质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒。
　　（14）酶：①限制性内切核酸酶；②PrimerSTAR Mix DNA聚合酶（TaKaRa，日本）③T4DNA连接酶，T4PNK环化酶（NEB，英国）④Gibson组装试剂盒
　　（南京诺唯赞公司）。
　　（15）常用化学试剂：甲醇、乙醇、异丙醇、冰乙酸、HCl、钠盐、钾盐、Tris-base、Tris-HCl、IPTG、X-gal溶液等。
　　3.设备
　　（1）生物安全柜（ESCO，型号ULPA）
　　（2）恒温培养箱（Panasonic，型号MIR-154-PC）
　　（3）生化培养箱（太仓，型号BSP-150）
　　（4）微氧培养箱（ShellabBactrox）
　　（5）恒温摇床（太仓，型号THZ-C-1）
　　（6）高压灭菌锅（Panasonic，型号MLS-3781L）
　　（7）冷冻离心机（Eppendorf，型号Centrifuge5430）
　　（8）高速离心机（Eppendorf，型号Centrifuge5418）
　　（9）高速冷冻离心机（Eppendorf，型号Centrifuge 5418R）
　　（10）荧光定量PCR仪（BIO-RAD，CFXConnectReal-time System）
　　（11）PCR仪（ESCO）
　　（12）金属浴（奥盛，型号Thermo-Shaker MS-100）
　　（13）分光光度计（ThermoFisher Scientific，型号Spectronic200）
　　（14）全波长多功能微孔板检测仪（Tecan，型号ProNanoQuant）
　　（15）倒置显微镜（ZEISS，型号Axio ObserverA1）
　　（16）显微镜相机（ZEISS，型号AxioCam503）
　　（17）细胞破碎仪（聚能，型号JN-mini）
　　（18）超声波破碎仪（新芝，型号JY88-IIN）
　　（19）电转仪（BIO-RAD）
　　（20）蛋白质电泳仪（BIO-RAD）
　　（21）核酸电泳仪（BIO-RAD）
　　（22）半干转印仪（BIO-RAD，型号

目录
**章 **微生物系统实验技术 1
**节 细菌趋化行为的观测及趋化系统信号转导蛋白的鉴定方法 1
一、背景 1
二、材料与试剂 3
三、操作步骤 6
参考文献 18
第二节 细菌群体感应信号的研究方法 18
一、背景 19
二、材料与试剂 20
三、操作步骤 21
参考文献 33
第三节 细菌VI型分泌系统蛋白杀伤试验与效应蛋白功能鉴定 34
一、背景 34
二、材料与试剂 36
三、操作步骤 38
参考文献 51
第四节 细菌毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究方法 52
一、背景 53
二、材料与试剂 54
三、操作步骤 58
参考文献 82
第二章 新兴衍生微生物方向实验技术 84
**节 细菌生物被膜的体外动态培养和观测方法 84
一、背景 84
二、材料与试剂 85
三、操作步骤 86
参考文献 98
第二节 持留菌的分离及检测方法 99
一、背景 99
二、材料与试剂 101
三、操作步骤 102
参考文献 105
第三节 铜绿假单胞菌体外竞争实验及显微镜观察方法 107
一、背景 107
二、材料与试剂 108
三、操作步骤 109
参考文献 116
第四节 新型生防菌的鉴定及功能机制研究方法 117
一、背景 118
二、材料与试剂 120
三、操作步骤 123
参考文献 143
第三章 交叉领域中的微生物实验技术 147
**节 光遗传技术调控工程细菌游泳运动和裂解行为的方法 147
一、背景 147
二、材料与试剂 149
三、操作步骤 150
参考文献 154
第二节 病毒体外感染及复制模型的构建及检测方法 155
一、背景 156
二、材料与试剂 157
三、操作步骤 159
参考文献 171
第三节 类器官模型在病原感染机制研究中的应用 171
一、背景 172
二、材料与试剂 174
三、操作步骤 175
参考文献 191
第四节 抗病毒单克隆抗体的快速筛选和功能表征 191
一、背景 192
二、材料与试剂 193
三、操作步骤 194
参考文献 217
第四章 基因编辑技术与高通量技术在微生物研究中的应用 219
**节 CRISPR基因编辑技术在细菌功能基因组中的应用 219
一、背景 219
二、材料与试剂 221
三、操作步骤 224
参考文献 237
第二节 细菌新型防御系统结构与功能研究方法 237
一、背景 238
二、材料与试剂 239
三、操作步骤 242
参考文献 261
第三节 转座子高通量测序技术在细菌生物被膜研究中的应用 263
一、背景 263
二、材料与试剂 264
三、操作步骤 265
参考文献 273
第四节 细菌基因组高通量等位基因标记及侵染过程动态示踪策略 274
一、背景 274
二、材料与试剂 275
三、操作步骤 276
四、展望 284
参考文献 285