本书从反向遗传学角度关注昆虫病原真菌的开发利用及其作用机制。第一章主要介绍农业害虫病原真菌的研究背景和概况。理论上，所有的昆虫都易受病原真菌感染而致病，故当昆虫病原真菌传播和扩散时，就会造成昆虫群体感染而大面积死亡。当前，环境问题日益突出，因施用化学农药而造成的健康问题更是引人注目，于是开发可替代化学农药或者补充性的生物农药以保护环境，并提供绿色的、健康的食品显得非常重要。利用昆虫病原真菌控制农业有害昆虫，实施生物控制和病虫害综合治理（IPM）是造就绿色环境的重要途径。在昆虫病原真菌的生活史中，首先是孢子遇到昆虫后通过分泌的黏液附着到昆虫体表，同时孢子膨大，萌发产生芽管。芽管在昆虫体表找到合适的位点后开始进行穿透。然后芽管的顶端开始膨大产生附着胞，附着胞进而产生穿透钉，穿透钉透过表皮进入昆虫血腔，进入血腔后，菌丝由丝状转变为酵母状的虫菌体，虫菌体以血腔中的血液为营养基迅速繁殖生长。昆虫死亡后，病原真菌从血腔内穿透皮层再次产生分散的孢子进入下一个周期。前人对昆虫病原真菌侵染机制的研究主要集中在毒力基因的作用机制上，而对其他基因的作用机制探索甚少。本书第二章针对基因编辑技术的详细操作和结果分析做介绍，能够促使研究者很快进入实验室，实现基因功能的研究。这些技术是目前从事基因功能研究的必要手段，是从事该领域的科技工作者必须熟练掌握的技能。第三章的内容背景是当今生物基因DNA的测序数据总量在以指数级速度增长，如何对数据库中海量数据进行科学搜集、管理、挖掘、注释，已成为基因组学与蛋白质组学研究的热点。为普及和提高我国基因功能研究者掌握生物信息学科知识，学习掌握序列数据分析的实用操作技能，及时了解该领域的最新进展，本章介绍了基因功能研究领域的具体应用实例。主要学习数据库搜索与常用工具的操作应用，采用“一步一图”的方式，边介绍边示范，读者可以备上电脑，跟着本书的说明一步步操作，可在较短时间内掌握基本操作程序。为满足读者的需要，根据科学研究近期发展，本书新增了一些软件的操作数据、蛋白质数据和基因相关的结构显示与分析等内容。经过学习可以初步掌握上述方法，应用于自己的课题，可以快节奏、高效率地开展自己的研究工作。有助于读者在研究过程中打开眼界，增长见识，产生协作研究和学习的愿望。第四章在基因敲除的基础上研究基因β-tubulin和MaPpt1在病原真菌的作用机制。β-tubulin是组成微管的基本单元之一，微管又是构成细胞骨架的亚细胞结构成分。β-tubulin参与多种细胞生物学过程。在本书中探讨单一的β-tubulin基因对蝗绿僵菌的细胞形态、产孢和毒力的影响。敲除β-tubulin基因后，细胞核、脂滴和几丁质被运输到细胞壁的能力下降。β-tubulin基因的缺失导致菌丝弯曲和菌落密实聚集的形态。敲除β-tubulin基因后孢子梗的形成率和产孢量也显著下降。敲除β-tubulin基因使其侵染蝗虫的能力显著下降。侵染结构的形态分析表明：缺失β-tubulin基因会产生二叉型芽管，促使附着胞的形成率下降；尼罗红染色显示附着胞内的脂滴分布下降；PEG 800试验表明附着胞的膨压下降。在蝗虫活体内和在试管内蝗虫体液培养的β-tubulin基因缺失菌株再生能力都显著下降。综上所述，表明β-tubulin相关的微管运输功能在蝗绿僵菌的细胞形态、产孢和毒力方面是必需的。第五章介绍关于敲除丝状真菌蝗绿僵菌Ppt1/PP5基因的研究。其产孢进程从气生分生孢子到微循环产孢发生改变。虽然总体生长没有明显变化，但是突变体的菌落形态发生显著性改变。Mappt1突变菌株的热击反应和毒力没有变化，而其抗紫外的能力却显著提高。eGFP-MaPpt1蛋白的融合表达表明它定位在孢子的细胞质中，但是在生长的菌丝中定位在隔上。MaPpt1（Mappt1 vs野生型）的可能靶标通过磷酸化蛋白质组学被进一步证实。差异化基因（Mappt1 vs野生型）表达揭示了包括糖异生作用、核酸、脂肪酸和细胞信号网络的代谢过程。这些数据为MaPpt1在丝状真菌生长和分化方面的独特功能提供了科学依据。第六章对本书主要内容进行总结与展望。本人在编写过程中，对全部文字和图表进行认真修正和统一处理，以使全书文笔流畅连贯。为便于研究者在计算机上操作，还在相应的图表中做注释和符号标记。但是书中的错误和缺点仍在所难免，恳请读者指正。本书的编写得到周口师范学院的大力支持、鼓励和热忱推荐！期待本书的出版发行，能在宣传基因功能研究、普及生物学知识、培养年轻科学人才等方面做出应有的贡献。

第一章导论

11研究背景

12研究现状

121真菌侵染过程的研究

122真菌产生代谢物的研究

123侵染后的宿主防御研究

124相互作用的三级程度研究

125被侵染的昆虫致死性行为变化研究

126昆虫病原菌的传播方式研究

127昆虫宿主-病原菌模型的遗传多样性研究现状

128昆虫病原真菌的流行病学研究

129建模

1210控制潜力

1211毒力基因与非毒力基因

13研究技术路线

第二章基因功能的实验研究过程

21载体结构

22质粒的扩大培养与提取（以天根质粒提取试剂盒为例）

23质粒酶切

24回收酶切质粒（OMEGA凝胶回收试剂盒）

25目的基因的寻找与电子PCR

26酶切位点分析

27引物设计和接头添加

28PCR扩增

29上样电泳

210PCR产物回收

211酶切质粒回收物和PCR纯化产物的连接

212感受态大肠杆菌转化

213阳性克隆鉴定

214靶基因的下游片段重组

215重组完整的质粒电转到农杆菌

216农杆菌侵染目标真菌

217真菌转化子培养与PCR验证

2171真菌转化子培养与PCR验证过程

2172微量DNA提取试剂配方

218真菌转化子的Southern Blotting杂交验证

2181真菌基因组DNA提取

2182Southern Blotting杂交操作

第三章基因功能的生物信息学研究

31Motif的分析与再现

311序列下载

312Motif分析

313Motif分析再现

314MEME的应用

32Motif的批量分析方法

321文件准备

322导入数据与设置

323细节调整与文件保存

324空间位置大小调节

325文本设置

326其他

33多基因组比对和共线性分析Mauve软件

34蛋白质三维结构预测（SWISS-MODEL）

35同源性分析—进化树构建

351Mega软件构建进化树

352clustalx与Mega联合构建进化树

353在线比对与Mega联合构建进化树

354构建系统发育树需要注意的问题

355系统发育树的美化

36小RNA分析方法

361数据下载

362mRNA差异表达

363lncRNA差异表达

364miRNA差异表达

365ceRNA网络构建

37基因编码蛋白的二级结构预测

371PSIPRED Workbench在线预测

372COILS在线预测卷曲结构

373Jpred4在线预测

374scratchproteomics在线预测

375Predict Protein在线预测

376信号肽的在线预测

38蛋白质的物理化学性质预测

39基因的模体识别与解析

310蛋白结构的可视化

311基因的富集信号通路分析

312分子对接分析

3121分子对接的基础

3122Chimera软件分子对接过程

3123分子对接细节展示

3124分子对接结果平面化

313蛋白活性口袋的预测

314antiSMASH数据库—微生物次生代谢物合成基因簇查询和

预测

315蛋白的多级构比对分析

316Circos在线绘图

第四章蝗绿僵菌微管蛋白（β-tubulin）基因的功能

41研究背景

42研究的内容

43实验材料

431主要仪器设备

432主要试剂和培养基

44实验方法

441菌株和培养条件

442生物信息学分析

443真菌基因组DNA和RNA提取

444荧光染色及观察

445Southern blotting

446载体构建及转化子的获得

447孢子和虫菌体的计数

448产孢量的测定

449昆虫生测

4410PCR扩增程序和条件

4411数据处理

45结果分析

451蝗绿僵菌β-tubulin基因的生物信息学分析

452蝗绿僵菌目标基因β-tubulin基因敲除和回复转化子的

验证

453蝗绿僵菌β-tubulin基因对菌落形态和菌丝形态的

影响

454蝗绿僵菌β-tubulin基因对毒力的影响

455蝗绿僵菌β-tubulin基因对产孢的影响

456蝗绿僵菌β-tubulin基因对侵染结构附着胞的影响

457蝗绿僵菌β-tubulin基因在细胞核事件中的功能

46讨论

第五章蝗绿僵菌MaPpt1负调控微循环产孢和紫外抗性

51研究背景

52研究内容和技术路线

521研究内容

522研究技术路线

53实验材料

531主要仪器设备

532主要试剂和培养基

54实验方法

541菌株和培养条件

542生物信息学分析

543真菌基因组DNA和RNA提取

544荧光染色及观察

545Southern blotting

546载体构建及转化子的获得

547孢子和虫菌体的计数

548产孢量的测定

549昆虫生测

5410RNA的提取和定量分析

5411磷酸化蛋白质组学分析

5412数据处理

55结果分析

551蝗绿僵菌MaPpt1基因的生物信息学分析

552蝗绿僵菌MaPpt1目标基因的敲除和回复菌株的

构建

553蝗绿僵菌MaPpt1对菌落表型的影响

554蝗绿僵菌MaPpt1对产孢量的影响

555蝗绿僵菌MaPpt1对紫外逆境抗性的影响

556蝗绿僵菌中MaPpt1在湿热逆境中的作用和表达模式的

分析

557MaPpt1在紫外和湿热逆境中的作用

558蝗绿僵菌MaPpt1在不同培养基上对产孢的影响

559蝗绿僵菌MaPpt1对毒力的影响

5510蝗绿僵菌MaPpt1调控的信号途径材料的选择及RNA

质量评估

5511蝗绿僵菌MaPpt1 基因的敲除改变了产孢的信号

途径

5512蛋白质组学分析MaPpt1在产孢和UV抗性的作用

机制

5513MaPpt1调控的基因网络

56讨论

第六章主要结论与展望

附录

AqRT-PCR数字表达谱验证结果

B蛋白质组学分析结果

C蛋白质组学质谱图

D缩略词

E常用色素配制及使用方法

F常用抗生素配制及使用方法

G常用培养基

H常用试剂配制方法

I常用酸碱指示剂及变化范围

J常用生物鉴定引物