第l章 绪论
1.1 止血机制
1.1.1 初级止血
1.1.2 二级止血
1.1.3 凝血过程的调节
1.1.4 纤维蛋白溶解
1.2 凝血酶及其多种功能
1.2.1 凝血酶的结构
1.2.2 凝血过程中的凝血酶功能
1.2.3 蛋白酶活化受体
1.2.4 凝血酶在细胞信号传导中的作用
l.3 蛋白C及其多种功能
1.3.1 蛋白C的结构
1.3.2 蛋白C的激活
l.3.3 APC的抗凝功能
1.3.4 APC的细胞保护途径
l.3.5 抗凝血和细胞保护性质的分离
1.4 炎症和凝血
1.4.1 炎症概述
1.4.2 炎症激活凝血反应
1.4.3 凝血影响炎症
1.5 蛋白激酶C
1.5.1 PKC的结构和活化
1.5.2 PKc的功能
1.6 本书的主要工作
第2章 研究方法
2.1 人类蛋白c变异体的制备
2.1.1 构建野生型蛋白C载体
2.1.2 点突变的蛋白C突变体
2.1.3 XL10-Gold超感受态细胞的转化
2.1.4 质粒小规模纯化和突变验证
2.1.5 质粒大规模纯化和定量
2.1.6 菌群保存
2.2 重组人类蛋白C的表达
2.2.1 细胞培养
2.2.2 HEK 293细胞的稳定转染
2.2.3 细胞系的冷冻保存和复苏
2.2.4 蛋白C表达和收集
2.3 蛋白C纯化
2.3.1 阴离子交换色谱纯化蛋白C
2.3.2 纯化蛋白C的分析
2.4 .蛋白C变异体的主要特性鉴定
2.4.1 蛋白c酶联免疫吸附测定(ELISA)
2.4.2 使用BCA蛋白质测定评估总蛋白质含量
2.4.3 蛋白C激活
2.4.4 使用S2366测定法定量化活化蛋白C(APC)
2.4.5 “APC ELISA”测定蛋白C激活效率
2.5 校准的自动血栓造影(CAT)检测
2.5.1 CAT检测原理
2.5.2 正常混合贫血小板血浆的制备
2.5.3 磷脂囊泡的制备
2.5.4 使用CAT评估APC变体的抗凝活性
2.6 PARl裂解评估
2.6.1 HUVEC提取
2.6.2 HuvEc培养和传代
2.6.3 HUvEC冷冻保存
2.6.4 总RNA提取
2.6.5 RNA浓度的测定
2.6.6 PARleXO肽段cDNA编码片段的生成
2.6.7 PARlexo肽表达载体构建
2.6.8 PARlexo肽表达和分析
2.6.9 使用IMAC纯化PARlexo肽
2.6.10 PARlexo肽裂解分析
2.7 细胞信号传导分析
2.7.1 EA.hy926细胞培养
2.7.2 材料
2.7.3 Erkl／2磷酸化分析
2.7.4 内皮细胞渗透性分析
2.7.5 PKC8小干扰RNA(siRNA)转染
2.7.6 PKC蛋白转位分析
2.7.7 检测PKc或磷酸化PKC同工酶的免疫检测
2.8 统计分析
第3章 APC变体的制备
3.1 蛋白c变体的制备
3.1.1 蛋白C变体的生成和表达
3.1.2 蛋白C的纯化
3.2 蛋白C变体的表征
3.2.1 ELISA测定蛋白C的含量
3.2.2 蛋白C的活化
第4章 APC抗凝活性评估
4.1 正常血浆中的TF滴定
4.2 正常血浆中Protac的滴定
4.3 正常血浆中APc的抗凝活性
4.4 APC变体在蛋白c缺乏的人血浆中的抗凝活性
4.5 讨论
第5章 APC对PARl的切割活性
5.1 PARlexo肽的生成
5.2 使用IMAC纯化PARlexo肽
5.3 PARleXO肽的切割
5.4 讨论
第6章 APC和凝血酶对内皮细胞(ECs)的信号传导反应
6.1 APC和凝血酶对EC中Erkl／2 MAPK的激活
6.2 APC和凝血酶对EC屏障渗透性的调节
6.3 PARl和EPCR在APC介导的细胞信号传导中的作用
6.4 讨论
第7章 PKC在APC和凝血酶介导的内皮细胞反应中的作用
7.1 PKC参与PMA、APC和凝血酶诱导的Erkl／2磷酸化
7.1.1 直接PKC激活对Erkl／2磷酸化的影响
7.1.2 PKC同工酶在凝血酶诱导的Erkl／2磷酸化中的作用
7.1.3 PKC在APC诱导的Erkl／2磷酸化中的作用
7.2 .PKC参与凝血酶或APc诱导的内皮屏障调节
7.2.1 PKC参与凝血酶诱导的内皮屏障功能障碍
7.2.2 PKC参与APC介导的内皮屏障保护作用
7.3 凝血酶或APC引起的PKC激活
7.3.1 PKC同源物转位
7.3.2 PKC磷酸化的评估
7.4 凝血酶诱导的EC屏障破坏依赖于Erkl／2的活化
7.5 讨论
第8章 总结
8.1 讨论
8.1.1 蛋白C及其变体的表征
8.1.2 APC的细胞保护性信号转导机制及其治疗潜力
8.1.3 靶向PKC的治疗前景
8.2 总结与展望
参考文献
附录
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