第一章低温纤维素酶
第一节概述
石油等不可再生能源的枯竭，使得可再生生物质能源的开发异常紧迫。我国作为农业大国，每年都会囤积大量农作物秸秆。截至2009年，我国农作物秸秆可收集资源量达到6.87x10st，理论资源量达到8.20x10st，占世界秸秆总量的20%～30%。目前，我国秸秆主要用于还田、制备粗饲料和肥料，以及生产食用菌，但农作物秸秆在短时间内很难被分解利用，导致其实际用量不超过总量的40%，大量被闲置或焚烧，带来了严重的资源浪费和环境污染。
农作物秸秆之所以难以被分解，缘于高等植物细胞壁中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素，这些结构通过非共价键及共价键紧密连接，形成木质纤维素这种复合物，占植物干重的70%～75%。一般来说，水稻等农作物秸秆中的纤维素含量为30%～35%，半纤维素含量为25%～30%，木质素含量为20%～25%。棉花中的纤维素含量将近100%，为纯天然的纤维素来源。纤维素功能众多，可用于制造人造棉和人造丝、炸药、胶卷、塑料、牲畜饲料，以及生产乙醇。但纤维素难以被降解，若能被酶高效附着并酶解，则会产生大量能量，以供生产利用。而在这些组分中，纤维素占比较半纤维素和木质素有明显优势，有很大的利用空间。
纤维素在环境中比较稳定，是地球上分布*广、*为廉价的可再生资源，可用于生产生物质能源。它是葡萄糖以β-1，4糖苷键结合形成的直链高分子化合物，经验式为，其中n是糖苷键数目，称为聚合度（DP），纤维素的聚合范围宽，可以从几百到15000左右，甚至更大。纤维素密度大、结构复杂，特别是结晶纤维素，若不使用化学或机械等方法预处理，则难以被水解。纤维素主要由排列整齐而规则的结晶区（crystalline）和相对不规则、松散的非结晶区（amorphism）两部分组成，结晶度一般在30%～80%，结晶区分子链内、链间及分子链与表面分子之间形成的氢键，使纤维素分子结构稳定难以被降解，非结晶区纤维素结构比较疏松，容易被分解利用。
自1906年在蜗牛消化液中被发现起纤维素酶就受到世界各国的重视。20世纪60年代，研究人员发现，利用微生物所产纤维素酶分解纤维素是一种相对高效且无污染的方法。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶的总称，是复合诱导酶，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，*终水解为葡萄糖。纤维素酶系主要包括内切葡聚糖酶[简称C1或EG，如内切1，4-p-D-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）]、纤维二糖水解酶（外切葡聚糖酶）[简称CX或CBH，如外切1，4-p-D-葡聚糖酶（EC3.2.1.91）和p-1，4-葡糖苷酶（简称BG，EC3.2.1.21）3种水解酶，在不同微生物合成的纤维素酶系中，3种酶所占比例不同。自然界中产纤维素酶微生物以真菌居多，细菌较少。前者所产纤维素酶活性高，但*适作用温度普遍较高，后者中有更多菌种能够产生耐低温性能较好的酶，但产纤维素酶活性较低。
目前的诸多工业生产及应对环境污染问题都有纤维素酶的参与。而低温纤维素酶因其反应所需能量低，更是被认为应用前景不可估量。
一、来源及分布
纤维素酶的来源十分广泛，自然界中的部分细菌、真菌、动物和植物等都具有合成纤维素酶的能力。国外于20世纪40～50年代就对产纤维素酶的微生物进行了大量的分离筛选工作，建立了较为完整的分离筛选方法。我国对纤维素酶的研究开始于20世纪60年代，选育出了一批纤维素酶菌种。目前，用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究得较多的有木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（.Penicinium）。产生纤维素酶的细菌主要有梭菌属（Clostridium）、纤维单胞菌属（GMuhmomas）、芽抱杆菌属（Bacillus）、高温单抱菌属（Thermomonospora）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、拟杆菌属（Bocteroz'des）、欧文氏菌属（Erwinia）、小双抱菌属（Micro况spora）和链霉菌属（Streptomyces）等。其中纤维单胞菌（Gcllulomotnas fimi）和高温单抱菌（Thermomonospora fusca）是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。
纤维素酶的分子特征和催化活性随来源而变化。近来，随着可持续、节能理念的提出，低温纤维素酶的研究逐渐增多，与同类型常温酶（*适作用温度多为45～65°C）相比，低温纤维素酶普遍存在*适作用温度低、低温（S40C）催化效率高、热稳定性差等特性，生产上只需较低温度的热处理即可使酶失活，既缩短了处理时间又节省了成本，更适合工业应用，部分低温纤维素酶的来源及性质如表1-1所示。
国外于1999年即发现低温纤维素酶，国内低温纤维素酶研究较晚。吕明生等（2007）从连云港高公岛海域的样品中筛选得到一株产低温纤维素酶的菌株。对该菌生物学特性进行研究发现，其为革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，生长温度为4～35°C，*适生长温度为25C，*适生长pH为8.0，*适NaCl浓度为3%，所产低温纤维素酶的*适作用温度为30C，该酶在10C仍具有较高活性，很有潜在的工业应用价值。*终鉴定菌株Z6为食鹿角菜交替假单胞菌carrageenovora）。
王玢等（2003）从黄海的深海海底泥样中筛选出一株产低温纤维素酶的海洋细菌，鉴定为革兰氏阴性杆菌。该菌既能产生羟甲基纤维素酶（CMCase），又能降解微晶纤维素，且有淀粉酶活性。研究人员对该菌生长特征及所产低温纤维素酶的性质进行了初步研究。该菌*适生长温度为20C，*高生长温度为40C，在0C也能生长，是典型的嗜冷菌。该菌所产低温纤维素酶*适作用温度为35C，在10C仍有较高活性，*适作用pH为6.0，属酸性酶。2003年，有人从15C的牲畜粪肥沼气池中分离到一种芽孢梭菌属细菌PXYL1，该菌生长温度为5～50C，*适生长温度为20C，被认为是耐冷菌。该菌分泌包括内切葡聚糖酶和滤纸纤维素酶在内的多种胞外水解酶，且这些酶*适作用温度均为20C。
曾胤新等（2005）从北极楚科奇海海水中分离出一株产低温纤维素酶的耐冷交替假单胞菌BSw20308，该菌*适生长温度为10C，35C不生长；pH7.0～8.0、含2.0%～3.0%NaCl的培养基*适宜菌株生长与产酶；可溶性淀粉、酵母浸出液分别是有利于菌株生长及产酶的碳源、氮源物质；蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖及麸皮对羟甲基纤维素酶（CMCase）的合成具有明显诱导作用；羟甲基纤维素钠（CMC-Na）、麸皮、可溶性淀粉及麦芽糖对滤纸纤维素酶的合成有一定诱导作用，单糖与部分双糖（蔗糖、纤维二糖及乳糖）则起阻遏作用；在指数生长后期至稳定早期，大量产CMCase;发酵液含CMCase、滤纸纤维素酶及葡糖苷酶，以CMCase活力*高；胞外CMCase活力占总CMCase活力的74.1%左右；酶*适作用温度为35°C，5C时酶活性保留50%左右；酶对热敏感，35C半衰期为3h，25°C下酶活性稳定；酶*适作用pH为8.0。
刘秀华等（2012）从采集的腐殖质土样中发现一株纤维弧菌，其具有琼脂液化和降解能力，所产低温纤维素酶*适作用温度为40°C，在0°C时的残留酶活性为*高酶活性的60%。
海洋是地球上*大的低温区域，从其中筛选低温酶为菌种开发新途径。在该生态系统中，产低温纤维素酶的低温菌几乎都属于交替假单胞菌属，而从其他环境中筛选出的菌属则有所不同。
二、国内外研究概况
国内外关于产低温纤维素酶菌株的研究主要集中在菌株的分离筛选、鉴定、培养条件的优化、生长特性、产酶条件优化、酶学性质研究及酶基因的克隆和表达方面。
（一）发展历程
自1906年纤维素酶在蜗牛消化液中被发现，其研究经历了三个阶段。
第一阶段：从1906年发现纤维素酶到1980年，主要研究纤维素酶的分离纯化。
第二阶段：1981～1988年，主要研究纤维素酶的基因克隆及一级结构预测。
第三阶段：1989年至今，主要研究纤维素酶的结构和功能。
早在1906年，Seilliere就在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶。20世纪70年代，一些学者提出需要多种纤维素酶协同作用，才能表现出很强的纤维素分解能力，之后有研究分离到协同作用的3种纤维素酶。2007年，美国能源部联合基因组研究所（Joint Genome Institute）与诺维信（Novozymes）公司美国研究部等多家机构首次发表了里氏木霉野生菌株QM6a的全基因组测序结果。2009年以来，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所与山东大学合作，开展了一株产纤维素酶青霉及其突变株的比较基因组研究，找到并验证了高产纤维素酶突变株的大量突变位点，包括纤维素酶编码基因启动子、蛋白酶表达调控因子和淀粉酶表达调控因子上的突变，并验证了存在多个增强子结合位点。
目前，主要是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析，功能性氨基酸的确定，水解双置换机制的确立，分子折叠和催化机制关系的探讨，以及关于纤维素酶检测方法的研究（Johnsenand Krause，2014）。
我国在20世纪就已经开始规模化生产纤维素酶。20世纪90年代初，黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产2000t纤维素酶生产线正式投产，我国成为继美国、日本、丹麦之后世界上第四个能生产纤维素酶的国家。我国对纤维素酶的需求量很大，年需求量在3000～4000t，虽然90年代后建成了一些纤维素酶生产厂，但目前国内主要研究集中在纤维素酶的特性、作用机制、培养条件、应用试验等方面，至今大多仍未能规模化生产，满足不了市场的需要。
（二）纤维素酶的理化性质
纤维素酶作为复合酶，在不同微生物中的分泌比例存在差异，即使同一菌株，在不同的底物、不同的培养基、不同的温度、不同的pH等生长条件下，所分泌的三种组分比例也不相同。纤维素酶的理化性质包括分子量、等电点、*适作用条件等，不同纤维素酶的分子量差异很大，等电点等也不尽相同，因此*适作用条件也存在差异。
结构决定性质，纤维素酶分子大小范围很广。一般内切酶分子质量为23～146kDa，外切酶为38～118kDa，p-葡糖苷酶为90～100kDa（胞内酶）和47～76kDa（胞外酶）。但也有一些酶的分子量比较特殊，如纤维黏菌的内切酶仅为6.3kDa，而蚕豆腐皮镰孢霉的p-葡糖苷酶的分子质量却高达400kDa。纤维素酶的等电点也存在较大差别。真菌纤维素酶的等电点一般在7以下，细菌纤维素酶的等电点一般大于7或在7左右。培养条件也会对酶的等电点产生影响，例如，棘胞曲霉产的纤维素酶，在液体培养时各组分的等电点为酸性；但在固体培养基中，酶组分的等电点为3.5～10.0，几乎散布在等电聚焦的两性电解质载体上。大部分真菌产的纤维素酶一般偏酸性，大多数纤维素酶组分的*适作用pH在5左右，但也存在一些耐碱或嗜碱纤维素酶被用于洗涤行业。
大部分纤维素酶的*适作用温度为45～65°C，低温纤维素酶*适作用温度可低至20°C。高活性低温酶的市场占比低，因此筛选高活性低温纤维素酶意义重大。
木霉和青霉可大量分泌胞外纤维素酶，但该酶对天然纤维素的降解能力弱；担子菌也可分泌胞外纤维素酶，该酶活性低但降解能力强；细菌所产纤维素酶位于细胞壁，分解天然纤维素能力强。
通过序列比对对纤维素酶的一级结构进行分析，可观察序列的同源性，因为同一家族的纤维素酶往往具有高度保守的氨基酸序列，所以同源性较高，易于判断和发现酶的种类与功能。现阶段的酶工程学将来自不同物种的作用于不同碳水化合物的酶根据碳水化合物活性酶数据库（CAZy）分成不同的酶家族，将氨基酸序列相似度超过30%的归为同一家族。现已经发现的131个家族中，纤维素酶
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