第1章 油脂生物科学基础
生物技术是一门涉及多领域的高新技术，它在解决疾病、食品、能源等重大问题上发挥了重要作用。生物技术的迅猛发展将为人们面临的各种重大问题提供更具前景的解决方案。在油脂相关领域，特别是油脂的高效合成、制备和应用方面，生物技术发挥了重要作用。
1.1 油脂分子生物学
分子生物学是从分子水平研究生物成分的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学，是当代生物科学的重要分支。
1.1.1 油脂类型及来源
动植物都含有油脂和类脂，它们统称为脂类。油脂从化学成分上讲，是由1分子甘油与3分子脂肪酸通过酯键相结合而成的三酰甘油（又称甘油三酯，TAG）。油脂是大多数生物中储存能量和供给能量的主要形式。类脂是构造或理化性质类似油脂的物质，主要包括磷脂、糖脂、蜡和甾族化合物。类脂是生物膜的主要组成成分，起着维持细胞的完整、区隔细胞内部不同结构的功能。脂类化合物的共同特征是：难溶于水而易溶于乙醚、氯仿、丙酮、苯等有机溶剂，能被生物体所利用，构成生物体的重要成分。
油脂主要分为植物油脂和动物油脂。
植物油脂主要来自一年生植物，如大豆、玉米、花生、菜籽和棉籽等；或者一些多年生的油料，如棕榈、橄榄和椰子。植物种子组织中的油脂聚集在直径约为1.0 μm的油脂体中。
动物油脂的来源为陆地动物和海洋动物。陆地动物油脂一般指乳脂和畜禽加工副产品炼制而来的油脂，如猪油、牛油、羊脂、家禽油等；海洋动物油脂一般来源于一些海洋哺乳动物（如鲸类）以及鱼类。动物的种类、品种以及成熟度都会影响动物油脂的品质。
除植物油脂和动物油脂外，微生物油脂越来越受到人们的广泛关注。微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下利用碳水化合物、普通油脂或一些碳氢化合物作为碳源、氮源从而合成的油脂，具有一定的商业价值。
1.1.2 植物油脂分子生物学
1. 植物油脂合成过程
植物种子中油脂的合成大致可以分为三个阶段：第一阶段是在质体中合成脂肪酸，第二阶段是在内质网中合成三酰甘油，第三阶段是生成的三酰甘油与油体蛋白结合形成油体的微粒体结构[1]。
第一阶段，脂肪酸的合成主要由脂肪酸合酶复合体催化进行。在种子的发育过程中，蔗糖作为合成脂肪酸的主要碳源，由蔗糖转运酶从光合作用器官转运到种子细胞中。蔗糖通过糖酵解途径生成己糖，并氧化成脂肪酸合成的前体物，即乙酰辅酶A（CoA）。乙酰辅酶A经过乙酰辅酶A羧化酶羧化生成丙二酰辅酶A，后者与酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）结合，生成丙二酰-酰基载体蛋白，并作为脂肪酸延长过程中碳链的供体，这个过程由丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转移酶催化。随后，在脂肪酸合酶复合体的作用下，1分子乙酰辅酶A与多分子丙二酰辅酶A经过缩合、羰基还原、脱水、再次还原等一列反应形成增加两个碳原子的酰基载体蛋白，再经过多次循环，生成含12～18个碳的脂肪酸。
第二阶段，生成的脂肪酸在内质网中形成三酰甘油。三酰甘油的合成前体是脂酰辅酶A和甘油-3-磷酸。脂酰辅酶A来自脂肪酸的活化，该步骤由单酰甘油（又称甘油单酯）酰基转移酶催化完成。甘油-3-磷酸和脂酰辅酶A在甘油-3-磷酸酰基转移酶作用下，形成1-单酰甘油-3-磷酸；随后在溶血磷脂酸酰基转移酶作用下被进一步酰基化形成1，2-二酰基甘油磷脂（磷脂酸)。磷脂酸在磷脂酸磷酸化酶作用下除去磷酸基，形成二酰甘油（又称甘油二酯，DAG）；*后在二酰甘油酰基转移酶作用下与另一分子脂酰辅酶A反应形成三酰甘油。三酰甘油所含的三个脂肪酸可以是相同的或不同的，可为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。
第三阶段，合成的三酰甘油与油体蛋白结合形成油体。油料作物常见的油体蛋白有四种：Cruciferin、Napin、Caleosin和Oleosin。Cruciferin又称为芸薹素，是一种高分子量的12S中性蛋白分子，由6个亚基组成。Napin是一种低分子量的1.7S蛋白，由两个以二硫键连接的多肽链组成。Caleosin是一种结合有Ca2+的油体表面结合蛋白，在油体膜结构的改变和油体之间的相互作用中起重要作用。Oleosin在三酰甘油积累的过程中附着在油体上，起稳定油体结构的作用。
2. 脂肪酸合成
按照脂肪酸合成过程的先后顺序，植物中脂肪酸合成主要涉及乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶。
1）乙酰辅酶A羧化酶
植物的乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是种子中脂肪酸合成的关键调控步骤，也是脂肪酸合成过程中的重要限速步骤，是脂肪酸合成反馈调节的作用位点[2]。乙酰辅酶A羧化酶存在于胞液中，其辅基为生物素，在反应过程中起到携带和转移羧基的作用。反应式如下：
ATP + 乙酰辅酶A + 碳酸氢根 = ADP + Pi + 丙二酰辅酶A
乙酰辅酶A羧化酶生成的丙二酰辅酶A一部分存在于质体中，作为脂肪酸从头合成的前体；另一部分存在于细胞溶胶中，作为脂肪酸延长和一些代谢反应的前体。研究发现，在种子发育过程中乙酰辅酶A羧化酶基因表达量与种子的含油量具有相关性。
乙酰辅酶A羧化酶在变构效应剂的作用下，可在无活性的单体与有活性的多聚体之间互变。柠檬酸与异柠檬酸可促进单体聚合成多聚体，增强酶活性；而长链脂肪酸可加速解聚，从而抑制该酶活性。乙酰辅酶A羧化酶还可以通过环磷酸腺苷（cAMP）的磷酸化及去磷酸化修饰来调节酶活性。此酶经磷酸化后活性丧失，从而抑制脂肪酸合成；促进酶的去磷酸化作用，可增强乙酰辅酶A羧化酶活性，加速脂肪酸合成。
自然界中的乙酰辅酶A羧化酶可分为两种形式。一种是原核型，也称多亚基或异质型乙酰辅酶A羧化酶，存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物的细胞质中。它是可解离成多个功能蛋白的多酶复合体，包括生物素羧化酶亚基、生物素羧基载体蛋白亚基、α-羧基转移酶，以及植物中由叶绿体基因组编码的β-羧基转移酶四种亚基，且以(BCCP)4(BC)2(α-CT)2(β-CT)2的复合体形式存在。另一种是真核型，也称多功能或同质型，只存在于真核生物中。它的肽链中含有三个功能结构域，即生物素羧化酶、生物素羧基载体蛋白和羧基转移酶，能够与原核形式的乙酰辅酶A羧化酶催化相同的反应，它主要在质体中起催化作用，这种乙酰辅酶A羧化酶一般以二聚体的形式存在。
A. 原核型乙酰辅酶A羧化酶
典型的原核型乙酰辅酶A羧化酶来源于拟南芥，其α-羧基转移酶和β-羧基转移酶的亚基是物理上相连的。乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的mRNA在合成脂肪酸组织中积累水平*高，包括快速生长组织中的膜结构和积累油脂的胚胎。进行转录和蛋白分析发现拟南芥生物素羧基载体蛋白1是组成型表达的，而生物素羧基载体蛋白 2 主要在种子中表达。原核型乙酰辅酶A羧化酶有些亚基的表达量很稳定，而另一部分亚基在外鞘部分表达量*高，不同的启动子对两种不同形式乙酰辅酶A羧化酶的表达起作用。同源的乙酰辅酶A羧化酶基因表现出同样的表达模式和相似的mRNA水平，这些基因在多倍体化之后都没有沉默或者获得新的组织特异性。
当生物素羧化酶基因表达水平被提高或略微降低时，并没有对植物表型产生明显影响；但当生物素羧化酶基因表达水平降低超过25%时，会导致在低光照条件下植物生长缓慢，且叶片脂肪酸的含量降低了26%。生物素羧基载体蛋白基因也在拟南芥中被过量表达和反义抑制，但得到的结果却是这两种途径都导致了乙酰辅酶A羧化酶催化活性的降低。
B. 真核型乙酰辅酶A羧化酶
植物真核型乙酰辅酶A羧化酶的编码序列一般很长，油菜、拟南芥等物种乙酰辅酶A羧化酶的mRNA编码区长度高达7 kbp，拟南芥中有两个拷贝，油菜中则更多。拟南芥真核型乙酰辅酶A羧化酶基因突变后会导致胚胎发育缺陷，并影响长链多不饱和脂肪酸的合成，导致甘油三酯的含量下降。将乙酰辅酶A羧化酶在油菜胚胎中进行反义抑制后，获得的转基因植株成熟种子的含油量比对照有显著的下降，并影响了碳水化合物代谢。
真核型乙酰辅酶A羧化酶过量表达可以提高植物的脂肪酸合成能力，从而提高植物的含油量。将真核型乙酰辅酶A羧化酶与叶绿体转运肽融合，在Napin启动子的作用下，成功将其在油菜的质体中过量表达，使乙酰辅酶A羧化酶活性比野生型对照提高了10～20倍，使种子脂肪酸的组成发生了变化，特别是油酸的含量大幅提高，且种子的含油量提高了5%。将拟南芥真核形式的乙酰辅酶A羧化酶在马铃薯块茎的造粉体中过量表达，使三酰甘油的含量提高5倍。
乙酰辅酶A羧化酶的产物丙二酰辅酶A也是很多生化过程的必需底物，被转运到细胞的不同部位作为代谢的底物；在植物的生长代谢过程中，糖类和氨基酸可以在细胞与细胞之间进行转运，但每个细胞所需的脂肪酸是无法进行转运的，只能由细胞自身合成。
2）脂肪酸合酶
在植物中，脂肪酸合酶复合体是由6种不同的酶加上酰基载体蛋白组成的多酶系统，底物和中间产物分子在复合体的各个功能结构域中传递，直到完成脂肪酸的整个合成过程。合成的过程包括如下六步反应。①装载，由丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶催化；②缩合，由β-酮酰-酰基载体蛋白合酶催化；③还原，由β-酮酰-酰基载体蛋白还原酶催化；④脱水，由β-羟酰-酰基载体蛋白脱水酶催化；⑤还原，由烯酰-酰基载体蛋白还原酶催化；⑥释放，由脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶催化。
由1分子乙酰辅酶A与多分子丙二酰辅酶A重复进行以上反应过程，每一次循环使碳链延长两个碳，一般生成含16～18个碳的脂肪酸。
A. 酰基载体蛋白
酰基载体蛋白是一个低分子量的蛋白质，它的辅基是磷酸泛酰巯基乙胺。这个辅基的磷酸基团与酰基载体蛋白的丝氨酸残基以磷酯键相连，另一端的巯基与脂酰基形成硫酯键，这样形成的分子可把脂酰基从一个酶反应转移到另一酶反应。该蛋白一般由多基因编码，仅在拟南芥中就有5个拷贝，推测油菜单倍体基因组中可能有高达35种酰基载体蛋白，并存在种子特异的酰基载体蛋白。反义抑制拟南芥的酰基载体蛋白会降低叶片中的脂肪酸含量，同时影响脂肪酸的组成和植物的生理状况，表明酰基载体蛋白在脂肪酸生物合成和叶绿体膜的发育过程中占据重要地位。
B. 丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶
乙酰辅酶A羧化酶的产物丙二酰辅酶A的下一步反应是由丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶催化丙二酰辅酶A的转酰基作用，使丙二酰辅酶A结合到活化的酰基载体蛋白上，生成丙二酰-酰基载体蛋白，即脂肪酸生物合成过程中的延伸底物。反应过程如下：
丙二酰辅酶A + ACP = 辅酶A + 丙二酰-ACP
大肠杆菌丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因的突变体称为fabD，对其晶体结构研究发现其保守的Gln11、Ser92、Arg117和His201氨基酸残基形成一个阴离子洞，承担重要的催化功能。玉米的丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因则是直接通过基因功能互补的方法筛选出来的，利用玉米的丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶制作探针筛选油菜的cDNA文库，得到了油菜中丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因，将此基因在大肠杆菌fabD突变体中表达，发现它能恢复丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因的生物活性，证明它具有丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶的功能。大豆中的丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因至少有两种等位酶形式，虽然生化性质有所不同，但都能催化转酰基反应，其中丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶主要在种子中表达，而在叶子中两种形式都存在。
利用农杆菌介导的转化方法，将大肠杆菌的丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因转化到油菜和烟草中，在Napin启动子的作用下使其在种子中过量表达，使种子发育过程中丙二酰辅酶A: 酰基载体蛋白转酰基酶基因活性提高了50 倍，但其活性提高并没有对脂肪酸的合成、种子的含油量等造成明显的影响，说明丙二酰辅酶A基因并非脂肪酸合成过程中的限速步骤。
C. β-酮酰-酰基载体蛋白合酶
在碳链延伸过程中，碳-碳键是通过产生β-酮酰-酰基载体蛋白而形成的。这些循环聚合反应是由三种不同的β-酮酰-酰
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