本书为Humana Press出版的“分子生物学方法”（Methods in Molecular Biology）系列丛书之一，原书作者都是相关领域的专家，针对基孔肯雅病毒研究相关的实验技术方法，以标准操作规程（SOP）的体例，从基本概念、实验原理到具体操作步骤，进行了详尽描述。本书内容涵盖了临床和诊断病毒学、细胞和病毒培养实验技术及细胞应答研究中的生物信息学与蛋白质组学方法、免疫学和动物模型研究、抗病毒药物和疫苗研发。 本书可供从事病毒学基础研究与临床检测的科研人员，以及从事病毒学相关学习和研究的本科生、硕士及博士研究生参考使用。

第一部分临床和诊断病毒学
　　第一章基孔肯雅病毒进化和流行病学
　　吉亚达 罗西尼，玛丽亚 波拉 兰迪尼，维托里奥 桑布里
　　摘要：基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种蚊媒传播病毒，隶属于甲病毒属，目前正在全球的热带地区传播。该病毒基因组RNA长度约11.8kb。*相关的传播媒介是伊蚊，其将3种不同的基孔肯雅病毒基因型由*早的发源地非洲传播至其他地方。*近的研究表明，在亚洲存在另外一个病毒起源地。自2004年基孔肯雅病毒从非洲海岸向东传播至印度洋以来，人们对基孔肯雅热的流行病学开始了广泛深入的研究。值得注意的是，这种传播主要是通过白纹伊蚊来维持的，由于病毒的E1蛋白发生Ala226Val突变后适应了白纹伊蚊，因此其成为基孔肯雅病毒新的传播媒介。在热带地区之外，分别于意大利北部（2007年）和法国南部（2010年）首次小规模暴发基孔肯雅病毒相关疾病期间，也发现了这种突变。三年后，该病毒首次出现在西半球，此后不到2年，就传播到了北美洲和南美洲。
　　关键词：基孔肯雅病毒，虫媒病毒，蚊子，进化
　　1.1引言
　　基孔肯雅病毒是一种由蚊子传播的病毒，自2004年以来已导致数百万人感染。在此之前，基孔肯雅病毒传播的范围只限于撒哈拉以南的非洲、印度次大陆和东南亚地区，如今已经扩散到亚热带地区和西半球。传播该病毒的蚊子媒介分布在全球的热带和温带地区，为基孔肯雅病毒继续传播到新的地理区域提供了条件[1，2]。
　　1.2病毒的传播循环和媒介
　　基孔肯雅病毒属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）。该病毒属于塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）抗原复合群，该复合群还包括阿良良病毒（O’nyong nyong virus）、马雅罗病毒（Mayaro virus）和罗斯河病毒（Ross river virus）。基孔肯雅病毒的基因组为一个大小约11.8kb的线性单股正链RNA。
　　CHIKV感染引起的疾病通常是自限性的，其特征是突然出现高烧、严重关节痛和皮疹，偶尔可能诱发神经系统和心脏的并发症。该疾病通常与持续性、致残性的关节炎有关。因此，大规模的基孔肯雅病毒流行会对经济发展造成十分严重的影响，尤其是对公共卫生方面构成严重的威胁。
　　对基孔肯雅病毒进行系统进化分析[3]确定了三个与地域相关的基因型，包括西非基因型、东/中/南非（ECSA）基因型和亚洲基因型。不同地理谱系基因型的基孔肯雅病毒株在亚洲的循环传播存在差异[4]。基孔肯雅病毒主要在城镇周期性往复循环传播，涉及家畜周边的蚊子（埃及伊蚊和白纹伊蚊）和人类。与此相反，在非洲，该病毒以人畜共患方式传播循环并维持在森林的伊蚊（Aedesfurcifer和Ae.africanus）和非人灵长类动物中。当疾病流行从森林循环向城市循环进行转换时，主要以蚊子作为媒介，在人类之间进行传播。非洲农村地区的疫情规模通常比亚洲小得多，原因可能是人口密度较低，也可能是非洲群体免疫力较稳定。虽然基孔肯雅病毒有至少三种基因型，但它只有一种血清型。因此，在人群中暴发后可产生群体免疫，从而提供保护。这也许可以解释为什么只有在流行地区出现大量的无免疫保护人群时，才会发生大规模的基孔肯雅病毒感染。然而，大规模的感染通常需要几十年的时间[5]。
　　1.3病毒的历史和起源
　　基孔肯雅病毒被认为起源于非洲，它以丛林中的伊蚊作为媒介在非人灵长类动物中广泛传播[3，4]。据历史记载，发热性疾病伴关节痛，可能由基孔肯雅病毒感染引起，这些发热性疾病在非洲地区已经存在了几个世纪或更长时间。在18世纪和19世纪时期[6]，基孔肯雅热可能在当初被描述为登革热等相关疾病。1952年，东非坦桑尼亚的马孔德高原暴发基孔肯雅热时，首次分离到基孔肯雅病毒[7]。CHIKV存在丛林自然疫源性循环的第一证据是在乌干达发现的。随后，CHIKV主要通过丛林中的蚊子传播到撒哈拉以南的非洲许多地区[8]。系统发育研究表明，这些撒哈拉以南的非洲地区代表性的基孔肯雅病毒株统称为东/中/南非（ECSA）谱系[3，4]。20世纪，在非洲撒哈拉以南的多个地区发生过基孔肯雅病毒的流行，在非洲其他地区和亚洲也有疫情零星发生。在亚洲地区，曼谷于1958年暴发流行基孔肯雅热时，首次分离鉴定到基孔肯雅病毒，当时的病毒主要通过埃及伊蚊传播[9]。1962年，印度报告了加尔各答和马德拉斯的首次基孔肯雅病毒疫情[10-12]。
　　*初认为，20世纪五六十年代在亚洲流行的基孔肯雅病毒是从非洲传过来的。然而，测序和系统发育研究[3，4]发现，1958～1973年，亚洲基孔肯雅病毒暴发时得到的分离株，是从东/中/南非谱系分离出来的一个独立分支，即亚洲谱系。1973年以后，基孔肯雅病毒亚洲谱系在印度绝迹，但是仍在东南亚循环传播，偶尔也会出现中小型的暴发流行。
　　1.42004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况
　　在2004年以前，基孔肯雅病毒在自然疫源地以外的流行地点寥寥无几[1]。有记录的、大规模的基孔肯雅病毒暴发流行包括1962～1964年泰国疫情、1963～1964年及1974年印度疫情[13，14]。此后30多年未见其他大规模疫情的报道，极有可能是因为流行地区的人群已经建立了群体免疫[4]。
　　2004年，在肯尼亚沿海发生基孔肯雅病毒疫情持续暴发，使得基孔肯雅病毒感染的流行病学和传播情况发生了转变[15]。2005年，疫情可能通过受感染的航空旅客传播到印度洋岛屿和印度次大陆，导致了暴发性的大流行，涉及数百万人[16-19]。该致病毒株属于新的进化谱系，起源于东/中/南非（ECSA）谱系，被命名为印度洋谱系（IOL）病毒株（表1-1）[20-22]。在印度洋和印度次大陆传播的基孔肯雅病毒中发现了两个不同的进化分支，它们源自东非，然后循着独立的进化过程传播到印度洋和印度次大陆[4]。其中被研究得*透彻的是在法属留尼汪岛暴发的疫情，波及30万病例[17]，主要媒介载体是白纹伊蚊。这些暴发严重的疫情受诸多因素影响，如日益增加的航空旅行、印度洋盆地的人群缺乏保护性免疫、高密度的传播媒介白纹伊蚊，以及新近暴发流行的印度洋谱系（IOL）病毒株发生的一系列适应性突变，从而增强了媒介白纹伊蚊对病毒的传播。在印度洋盆地，白纹伊蚊第一次被提示为基孔肯雅病毒暴发流行的主要媒介。基孔肯雅病毒在法属留尼汪岛暴发期间，其基因组测序表明，E1囊膜糖蛋白[21]中存在氨基酸突变，即第226位的丙氨酸（Ala）突变为缬氨酸（Val），这种突变使白纹伊蚊成为主要的传播媒介。实验感染也支持这样的假说，即CHIKV的E1-Ala226Val替换突变，使得病毒对媒介宿主白纹伊蚊更适应，从而增强了病毒通过媒介种属传播的能力[23，24]。在白纹伊蚊广泛分布的地区，CHIKV很可能会发生暴发性流行。由于白纹伊蚊广泛的地理分布，以及E1-Ala226Val CHIKV变异株对白纹伊蚊的适应性增强，因此白纹伊蚊对基孔肯雅病毒的全球流行病学产生了重要的影响。
　　印度洋谱系（IOL）基孔肯雅病毒在印度洋盆地和亚洲地区暴发流行高峰期，数千名受感染的旅行者将基孔肯雅病毒携带至世界各地。2007年意大利北部一名来自印度的病毒携带者[25，26]和2010年法国南部的病毒携带者[27]引发了小规模疫情，这两次疫情都是由白纹伊蚊引起的（表1-1）。由于CHIKV可通过白纹伊蚊媒介传播，这两次欧洲暴发的疫情突出表明温带地区也易发生基孔肯雅病毒播散，具有流行风险。该疾病疫情在2008年和2009年持续性地广泛传播流行，在泰国南部引发了一场波及近5万人的大规模疫情[28]（表1-1），此次的疫情暴发与印度洋谱系（IOL）基孔肯雅病毒有关，表明该谱系正在取代自20世纪50年代以来该地区原有并一直存在的亚洲谱系病毒株。然而，多年来，在东南亚一直存在着亚洲谱系和东/中/南非/印度洋谱系（ECSA/IOL）病毒株的共同循环[29，30]。　
　　1.5基孔肯雅病毒在西半球的感染情况
　　在西半球，第一个本地CHIKV感染病例于2013年12月发现于圣马丁岛（表1-1）[31]。此后，许多其他加勒比海群岛也报告了本土病例。受感染的旅行者携带来自周边岛屿国家的病毒，导致南美洲大陆出现了基孔肯雅病毒感染本土病例。序列分析表明，目前加勒比海地区的疾病暴发是由亚洲基因型基孔肯雅病毒引起的，可能是从东南亚或大洋洲输入的[32]。加勒比海地区流行的CHIKV病毒株与2012年中国分离株、2013～2014年密克罗尼西亚联邦雅蒲岛分离株密切相关，与2014年1月在英属维尔京群岛流行的病毒株非常相似[32]。这些表明了CHIKV亚洲基因型病毒株从东亚向西太平洋迁移的过程。亚洲基因型CHIKV病毒株已经扩散到中美洲国家、南美洲大部分地区、墨西哥北部和美国佛罗里达州。截至2014年8月，泛美卫生组织/世界卫生组织（PAHO/WHO）报告的本土病例已超过65万例。
　　迄今为止，加勒比海地区的疫情主要由埃及伊蚊传播。亚洲基因型CHIKV病毒株对白纹伊蚊的适应能力有限[33]，这可能限制了亚洲基因型CHIKV病毒株在温带地区的传播，包括美国南部，该地区的白纹伊蚊比埃及伊蚊更为常见。

目录
第一部分　临床和诊断病毒学　
第一章　基孔肯雅病毒进化和流行病学　3　
1.1　引言　3　
1.2　病毒的传播循环和媒介　3　
1.3　病毒的历史和起源　4　
1.4　2004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况　5　
1.5　基孔肯雅病毒在西半球的感染情况　6　
1.6　结语　7　
参考文献　7　
第二章　基孔肯雅病毒分子流行病学　10　
2.1　引言　10　
2.2　材料　12　
2.2.1　病毒RNA的提取　12　
2.2.2　一步法反转录-聚合酶链反应（One-step RT-PCR）　12　
2.2.3　聚合酶链反应（PCR）产物的琼脂糖凝胶电泳和纯化　13　
2.2.4　测序反应　13　
2.2.5　PCR测序产物的纯化　13　
2.3 方法　14　
2.3.1　病毒RNA的提取　14　
2.3.2　一步法RT-PCR　14　
2.3.3　琼脂糖凝胶电泳和纯化PCR产物　14　
2.3.4　测序反应　15　
2.3.5　纯化循环测序产物　15　
2.3.6　测序数据编辑　16　
2.3.7　系统发育树的构建　16　
2.4　注释　16
参考文献　17
第三章　高级遗传方法学在基孔肯雅病毒进化和传播追踪溯源研究中的应用　19　
3.1　引言　19　
3.2　材料　20　
3.3　方法　20　
3.3.1　序列生成　21　
3.3.2　从公共数据库获得序列　21　
3.3.3　多序列比对　21　
3.3.4　序列多态性和基因突变分析　22　
3.3.5　中值连接进化网络的构建　23　
3.3.6　生成一个时间尺度的贝叶斯系统发育树，并通过BEAST软件包计算目标序列到*近的共同祖先的时间（tMRCA）以确定祖先的年代　24　
3.3.7　BEAST跟踪输出的可视化　26　
3.3.8　用BEAST系统发育树输出方式构建*大分支可信度树　27　
3.3.9　一致*大分支可信度树的可视化　27　
3.3.10　通过BEAST2软件进行系统地理学分析来确定病毒株时空传播特点　27　
3.3.11　用SPREAD软件使系统地理学输出可视化　29　
3.4　注释　29
参考文献　32
第四章　基于合成肽的抗体检测方法诊断有无神经系统并发症的基孔肯雅病毒感染　34　
4.1　引言　34　
4.2　材料　35　
4.2.1　单向电泳　35　
4.2.2　双向电泳　36　
4.2.3　电洗脱　37　
4.2.4　液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　37　
4.2.5　多肽合成　37　
4.2.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　38　
4.3　方法　38　
4.3.1　单向电泳　38　
4.3.2　双向电泳　39　
4.3.3　电洗脱　41　
4.3.4　蛋白液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析　41　
4.3.5　多肽合成41　
4.3.6　酶联免疫吸附试验（ELISA）　42　
4.4　注释　43
参考文献　44
第五章　E2糖蛋白在Sf9昆虫细胞的表达和纯化及其在血清学中的应用　45　
5.1　引言　45　
5.2　材料　46　
5.2.1　昆虫表达组件的构建　47　
5.2.2　Sf9细胞的维持及E2糖蛋白的瞬时表达　47　
5.2.3　在昆虫细胞中稳定表达E2糖蛋白　47　
5.2.4　稳定表达细胞的冻存　48　
5.2.5　自然分泌CHIKV-E2的纯化　48　
5.2.6　基孔肯雅病毒的血清学诊断　48　
5.3　方法　48　
5.3.1　构建昆虫表达组件　48　
5.3.2　Sf9细胞的维持和E2糖蛋白的瞬时表达　49　
5.3.3　E2糖蛋白在昆虫细胞中的稳定表达　50　
5.3.4　稳定细胞的低温保存　51　
5.3.5　纯化自然分泌的CHIKV-E2蛋白　51　
5.3.6　CHIKV的血清学诊断　52　
5.4　注释　53
参考文献　54
第六章　基于血清学工具的CHIKV感染诊断方法　55　
6.1　引言　55　
6.2　材料　60　
6.3　方法　61　
6.3.1　血清样品的准备　61　
6.3.2　血清和病毒混合液的准备　62　
6.3.3　细胞培养　62　
6.3.4　用中和过的病毒感染细胞　62　
6.3.5　计算结果　62　
6.4　注释　62
参考文献　63
第七章　使用咽拭子及尿液标本诊断基孔肯雅病毒感染及其评价　65　
7.1　引言　65　
7.2　材料　66　
7.2.1　病毒检测　66　
7.2.2　ELISA检测IgM抗体　66　
7.2.3　体外病毒分离　67　
7.2.4　体内病毒分离　67　
7.3　方法　67　
7.3.1　通过分子生物学技术和测序分析检测病毒基因组　67　
7.3.2　IgM抗体捕获-ELISA血清学检测　68　
7.3.3　体外病毒分离　69　
7.3.4　体内病毒分离　70　
7.4　注释　70
参考文献　71
第二部分　细胞培养、病毒复制和细胞反应　
第八章　用蚊子细胞扩增基孔肯雅病毒　75　
8.1　引言　75　
8.2　材料　76　
8.2.1　培养C6/36细胞　76　
8.2.2　病毒扩增　76　
8.3　方法　76　
8.3.1　培养C6/36细胞　76　
8.3.2　病毒扩增　77　
8.4　注释　78　
参考文献　79
第九章　基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蚀斑试验　81　
9.1　引言　81　
9.2　材料　82　
9.3　方法　83　
9.3.1　收集用于蚀斑试验的样本　83　
9.3.2　接种BHK-21细胞于24孔板　84　
9.3.3　蚀斑试验　84　
9.4　注释　86
参考文献　88
第十章　实时RT-PCR检测与定量分析基孔肯雅病毒　90　
10.1　引言　90　
10.2　材料　91　
10.2.1　寡核苷酸序列　91　
10.2.2　病毒RNA提取　91　
10.2.3　常规RT-PCR　91　
10.2.4　PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及纯化　92　
10.2.5　体外转录合成cDNA　92　
10.2.6　一步法SYBR Green I实时RT-PCR　92　
10.2.7　一步法TaqMan实时RT-PCR　92　
10.3　方法　92　
10.3.1　病毒RNA提取　93　
10.3.2　体外转录PCR产物的制备　93　
10.3.3　琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化　93　
10.3.4　体外转录　94　
10.3.5　RNA转录物的纯化　94　
10.3.6　总RNA产量的计算　94　
10.3.7　体外转录RNA拷贝数测定　95　
10.3.8　用于RNA绝对定量的标准品构建　95　
10.3.9　基于SYBR-Green I的实时RT-PCR的绝对定量　95　
10.3.10　基于TaqMan的实时RT-PCR的绝对定量　97　
10.3.11　定量未知样本中CHIKV载量　97　
10.4　注释　98
参考文献　100　
第十一章　伊蚊的基孔肯雅病毒感染　102　
11.1　引言　102　
11.2　材料　103　
11.2.1　含CHIKV的血液（CHIKV血饲）　103　
11.2.2　蚊子感染　103　
11.2.3　从蚊子收集CHIKV　104　
11.2.4　处理采集的蚊子脏器　104　
11.3　方法　104　
11.3.1　准备含病毒的血食物　104　
11.3.2　蚊子感染　105　
11.3.3　采集和处理受感染蚊虫的脏器　106　
11.3.4　处理采集的蚊虫组织器官　108　
11.4　注释　108　
参考文献　109　
第十二章　人工血食物感染蚊虫中CHIKV的分析　111　
12.1　引言　111　
12.2　材料　112　
12.2.1　蚊子的饲养　112　
12.2.2　制备含感染性CHIKV的血食物　113　
12.2.3　感染后蚊子的处理　113　
12.2.4　核酸的检测与定量　114　
12.3　方法　115　
12.3.1　埃及伊蚊和白纹伊蚊群落的饲养　115　
12.3.2　蚊子感染性血饲流程　116　
12.3.3　暴露后蚊子处理：通过分析CPE检测蚊子中的病毒　117　
12.3.4　暴露后蚊子处理：强迫唾液分泌　118　
12.3.5　CHIKV核酸检测与定量　119　
12.4　注释　119
参考文献　121　
第十三章　基孔肯雅病毒生长与荧光标记：免疫荧光法检测基孔肯雅病毒　122　
13.1　引言　122　
13.2　材料　123　
13.2.1　病毒生长　123　
13.2.2　荧光显微镜　123　
13.2.3　使用IFA进行血清学诊断　124　
13.2.4　流式细胞术　124　
13.3　方法　125　
13.3.1　细胞生长　125　
13.3.2　荧光显微镜下确定病毒的生长　125　
13.3.3　应用IFA进行血清学诊断　126　
13.3.4　流式细胞术测定病毒生长　127　
13.4　注释　127　
参考文献　128　
第十四章　用蔗糖密度梯度分离和制备基孔肯雅病毒样本用于透射电镜观察　130　
14.1　引言　130　
14.2　材料　131　
14.2.1　CHIKV的分离与扩增　131　
14.2.2　病毒纯化　131　
14.2.3　负染色和免疫金标记法　132　
14.3　方法　132　
14.3.1　分离CHIKV　132　
14.3.2　CHIKV滴定　133　
14.3.3　大规模扩增CHIKV用于病毒纯化　134　
14.3.4　聚乙二醇（PEG沉淀）纯化病毒　134　
14.3.5　不连续的蔗糖梯度纯化病毒　135　
14.3.6　负染法　136　
14.3.7　免疫胶体金标记　136　
14.4　注释　137　
参考文献　138　
第十五章　酵母双杂交筛选法研究病毒-宿主蛋白的相互作用　139　
15.1　引言　139　
15.2　材料　141　
15.2.1　GAL4 Y2H系统中使用的酵母菌株和质粒　141　
15.2.2　培养基　141　
15.2.3　酵母转化　142　
15.2.4　准备酵母蛋白提取物　143　
15.2.5　BD病毒融合构建物自激活的检测　144　
15.2.6　病毒-宿主相互作用文库的筛选　144　
15.2.7　酵母菌落PCR　144　
15.2.8　多重库质粒的排除　145　
15.2.9　限制性消化排除重复文库质粒　145　
15.