第一章外周血涂片检查
制备染色良好的血涂片是显微镜下清晰、准确地解释结果的关键。
一、外周血涂片制备
血液采集于乙二胶四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）二钾盐抗凝剂中，浓度为1.50±0.25mg/mL。血液与EDTA比例至关重要，过量EDTA会导致细胞的皱缩和退化，特别是红细胞（red blood cell，RBC）。
血涂片质量与制备血涂片材料的质量密切相关。载玻片必须是高质量的。采用预先清洗、末端磨砂的载玻片，同时为了安全最好使用边缘呈楔形的载玻片。用于制备血涂片的推片也应具备较高质量，且边缘呈楔形。
（1）血涂片制备后立即于安全柜内的冷风机前干燥。
（2）血涂片使用AR级甲醇固定。
（3）使用瑞氏染液（Wright’s stain）或其他罗曼诺夫斯基（Romanowsky stain）染液染色。
（4）血涂片用高质量的封片剂封片。全面系统地检查血涂片。
（5）低倍镜（x10倍）检查血涂片尾部血小板（platelet，Plat）聚集及自细胞（white blood cell，WBC）数量和分布情况。
（6）检查RBC是否呈缗钱状，并判断缗钱状程度与红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）结果的一致性。
（7）高倍镜（x40倍）进行WBC分类。
（8）估计Plat计数并与血液分析仪的检测结果对比。
（9）检查RBC的大小、形态和颜色。
（10）油镜（x100倍）检查厚血膜上是否存在疟原虫（薄血膜涂片使用x40倍检查）。
（11）必要时检查RBC包涵体。
（12）手工网织红细胞百分比计数（reticulocyte count，RETIC CT）。
二、人为因素引起的细胞形态改变
（一）人为因素引起红细胞形态改变
（1）陈旧血液：血液在EDTA中储存超过6小时，会导致RBC逐渐皱缩。
（2）标本采集困难导致血液量与EDTA不成比例，过量EDTA会引起RBC皱缩。
（3）甲醇中的水分导致RBC呈面包圈状，造成一种低色素的假象。
（4）血涂片未及时干燥，RBC膜吸收空气中的水分，RBC表面积增加不均匀，形成“假性”靶形RBC。
（5）加热导致球形RBC和RBC碎片增加，引起Plat计数假性升高。
（二）人为因素引起自细胞形态改变
1.陈旧血液
血液在EDTA中储存超过24小时，中性粒细胞和单核细胞的胞浆内可出现空泡。中性粒细胞的细胞核出现退化。核分叶并呈固缩状，即为细胞凋亡。
2.人为破碎
WBC在血涂片制片过程中可能会挤压损伤，特别淋巴细胞增殖性疾病时的淋巴细胞。这种被挤压破坏的细胞称为破碎细胞或涂抹细胞。通过添加白蛋白（9滴血液中加人1滴30%白蛋白），然后制片可以降低这种影响。
（三）人为因素引起血小板形态改变
1.采血困难
不正确的静脉穿刺可导致Plat聚集或成簇。当Plat计数突然减少时，需要通过血涂片检查，特别是血涂片尾部观察有无聚集现象。
2.Plat卫星现象
通常是EDTA诱导的抗体介导Plat粘附在中性粒细胞膜上。Plat卫星现象会导致Plat计数假性减少。
3.染色质量
染液沉渣、染色时间不正确，以及染色液与缓冲液比例不恰当，缓冲液pH不正确，都可能导致染色质量变差。
三、红细胞
在RBC分布均匀，互不重叠的区域进行RBC观察。应避免在涂片尾部和血膜较厚区域，尤其是RBC呈缗钱状时。
（一）分类
1.大小（大小不均）
红细胞分布宽度（red cell distribution width，RDW）是反映RBC大小不均的参数。
体积大的RBC称为大阻RBC，相应体积比较小的RBC称为小RBC。
2.形态（异形红细胞增多）
异形RBC是指形态异常的红细胞，在红系造血异常、病理性疾病或遗传性疾病时可产生异形RBC。
3.颜色
正色素性、低色素性、高色素性和多染性。
（二）红细胞分布宽度
RDW是反映RBC大小不一或变异的参数。RBC大小变化的程度称为RBC大小不均，分为轻度（+），中度（++）或大量（+++）。因为网织红细胞体积大于成熟红细胞，评估RBC大小不均程度时应排除网织红细胞。
RBC大小不均是许多RBC疾病中的一个重要参数，可有助于某些贫血的鉴别诊断。
（1）红细胞分布宽度变异系数（coefficient of variation of RDW，RDW-CV）（参考区间<14.5）/红细胞分布宽度标准差（standard deviation of RDW，RDW-SD）（参考区间<48）。
（2）缺铁贫时RDW增加，而年龄为6月至5岁儿童（也可能存在缺铁）的RDW降低。
（3）轻型地中海贫血RDW降低，中间型地中海贫血和重型地中海贫血RDW增加。骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）RDW升高。
（4）同时存在小红细胞和大红细胞时可定义为中度RBC大小不均。
（三）形态
对某个特定疾病解释的关键是需要一张制片、染色良好的血涂片进行异形RBC观察。而且某些病理情况可以在血涂片上发现特定形态的RBC。
为此，形态学人员须牢记描述RBC形态的标准命名。相比体外人为因素导致的RBC形态变化，识别“真正”RBC形态的能力对于血涂片准确报告至关重要。而描述RBC形态数量的程度也有临床意义。一般来说，形态学人员对血涂片中偶尔出现的RBC形态不需要做评论。轻度、中等或大量异常RBC形态则提示病理变化。使用“偶尔”一词可能会混淆临床诊断。
RBC若不呈双凹圆盘状或圆盘状，就是异形红细胞，所以并不推荐用“异形RBC”来描述RBC形态变化。若血涂片上RBC发生形态改变，应报告这些单一的形态变化。通过这种报告方式，形态学人员和临床医生就能清楚地明确诊断。
（四）命名
1.正常RBC（discos=圆盘/圆盘状）
正常RBC呈双凹圆盘状或圆盘状细胞，平均直径为7μm，相当于一个小淋巴细胞核的大小（图1-1、图1-2）。
RBC膜有很强的弹性和可塑性，未加变形力后，RBC膜易恢复为圆盘状。
图1-1正常RBC 1
图1-2正常RBC 2
2.小RBC（micrós=小）
小RBC是直径减小的RBC，直径小于6μm，细胞厚度变薄（图1-3）。小阻RBC所含血红蛋白（haemoglobin，Hb）浓度降低，且常集中分布在RBC外围，而中央区呈苍白色。中央淡染区可增大，以至RBC呈薄而扁平。小RBC是缺铁性贫血和/或地中海贫血的形态特征。
图1-3小RBC
3.大RBC（macrós=大）
大RBC是直径增大的RBC，直径大于8μm；呈正常的圆盘状，伴清晰的中央淡染区（图1-4）。大RBC是酒精中毒和肝病的形态特征。
图1-4大RBC
4.卵圆形大RBC（macrós=大）
卵圆形大RBC是直径超过9μm的巨型RBC（图1-5）。这种RBC形态是巨幼细胞性贫血的形态特征。
图1-5卵圆形大RBC
