本书较为系统地介绍了环境科学与工程专业领域涉及的分子微生物学原理与技术。全书共分为八章，第一章主要介绍了分子微生物学概念、发展史及基本研究内容；第二章系统介绍了微生物细胞大分子与分子生物学中心法则涉及的基础知识；第三至五章主要介绍了原核微生物细胞结构与分子组成，进化、系统发育与分类，以及微生物代谢；第六章主要从分子层面介绍了病毒性质、复制周期、宿主影响等基本知识；第七章描述了环境分子生物学分析方法与技术的原理及应用；第八章从胞外电子传递角度介绍了微生物电子传递的分子机制及环境应用。 本书可作为高等学校环境科学与工程等专业本科生与研究生教材，同时，还可供从事环境微生物学相关领域工作的科研人员及技术人员参考。

1 导 论
　　1.1 分子微生物学概念
　　分子生物学这一术语早在1938年就由Warren Weaver首先使用，随后得到包括研究生物大分子结构的William Astbery等学者的广泛使用。广义分子生物学是指在分子水平上研究生命现象，或用分子的术语描述生命现象的学科。早期的狭义分子生物学则指在核酸与蛋白质水平上研究基因复制、基因表达（包括RNA转录、蛋白质翻译）、基因表达调控及基因突变与交换的分子机制。作为DNA双螺旋结构发现人之一的James D. Watson将这种狭义的分子生物学也称为基因分子生物学。
　　分子微生物学是微生物学的一个分支。基于分子生物学概念，分子微生物学是在核酸（DNA和RNA）、蛋白质等分子水平对微生物遗传、生长等生命过程分子机理进行的研究与认识。这里的分子水平是指那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递或细胞内外通信过程中发挥重要作用的电子、能量、信号传递等分子载体。其中，核酸、蛋白质等生物大分子分别由简单的核苷酸、氨基酸等小分子通过排列组合蕴藏大量生物信息，并进一步利用复杂的空间结构形成精确的相互作用体系，由此构成微生物多样性和微生物个体精确的代谢调节控制系统。阐明这些复杂大分子结构及结构与功能的关系是分子微生物学的主要任务。
　　分子微生物学是由生物化学、微生物学、细胞学、病毒学及生物信息学等多学科相互渗透、融合产生并发展而来。分子微生物学的发展对微生物学、医学与环境科学及其他学科的发展也产生了深远影响。同时，材料、物理、分析化学等学科在分子水平上的发展也极大地推动了分子微生物学与这些学科的相互交叉和渗透。分子微生物学从研究微生物细胞内部组成的大分子结构及其生物学功能开始，逐步延伸到在分子水平上认识微生物生长与分化、信息传递、基因表达与调控、遗传、进化等过程，并进一步延伸到复杂微生物群落中功能微生物的基因组学、转录组学、蛋白质组学等。
　　1.2 分子微生物学发展史
　　在1665年英国物理学家Robert Hooke发现细胞后，德国植物学家Matthias Jakob Schleiden和动物学家Theodor Schwann在1838～1839年提出了细胞学说，认为细胞是生命体组成的基本单位，论证了生物体结构的统一性，并提出细胞为动植物进化上的共同起源。1859年，英国科学家Charles Robert Darwin在《物种起源》一书中基于大量考证资料和科学分析，提出了物种通过变异、生存竞争而实现“物竞天择，适者生存”的进化论。进化论的提出对当时流行的神创论及物种不变论提出了根本性的挑战，成为生物学发展史上的一个重要转折点。进化论与细胞学说同为19世纪*重要的自然科学发现之一，二者的结合促进了现代生命科学的形成。
　　1868年，奥地利遗传学家Gregor Mendel通过豌豆杂交实验发现了遗传上的分离定律、自由组合定律，成为遗传学的奠基人。此后，美国实验动物学教授Thomas Hunt Morgan不仅在1910年的果蝇杂交实验中证实了Mendel从豌豆实验中总结的遗传规律，还进一步发现并提出了连锁定律，该定律与分离定律及自由组合定律一起成为遗传学三大定律。19世纪末至20世纪初，生物化学步入快速发展时期：生物化学家发现了糖酵解途径、尿素循环、三羧酸循环等主要代谢途径，得到了模拟细胞内环境特性的“缓冲溶液”系统，提出了“胶体”理论，为酶学研究奠定了基础。同时，生物大分子以氢键、离子键发生相互作用的现象与生物化学其他原理一道加深了我们对生命形式的结构与功能的理解。因此，以研究基因的遗传和变异规律为主要内容的遗传学与以研究细胞内活性物质代谢规律为主要目标的生物化学形成分子生物学的两大支撑学科。
　　在现代生命科学与分子生物学形成、发展期间，微生物学逐渐发展起来。在Robert Hooke发现细胞的同一时期，荷兰科学家Antonie van Leeuwenhoek利用自制显微镜发现了包括细菌在内的多种微生物，成为“微生物学之父”。在随后的19世纪60年代，法国化学与微生物学家Louis Pasteur及德国医生及微生物学家Robert Koch建立了早期的微生物研究方法，包括否定“自然发生说”的巴氏消毒法、微生物固体培养基培养与分离、细菌细胞染色等技术与方法，成为微生物学的奠基人。
　　进入20世纪之后，在现代生命科学、分子生物学及微生物学发展及电子显微镜等高新技术出现的基础上，分子微生物学进入了快速发展时期（表1.1）。
　　表1.1 分子微生物学发展里程碑
　　1.2.1 一个基因一个酶
　　1941年，George Beadle和Edward Tatum以红色面包霉（Neurospora crassa）为研究对象，提出“一个基因一个酶”（one gene-one enzyme）的假说（获得1958年诺贝尔生理学或医学奖），说明了基因的生化作用本质是控制酶的合成，每个酶都对应着一个基因。这一科学发现促使了生物化学和遗传学之间的联合，也是分子生物学史上的重大发现。后续研究表明，“一个基因控制一个酶”并不意味着“一个基因就足以指导合成一个酶”。因为蛋白酶通过众多氨基酸聚合形成多肽链，合成一个酶需要若干酶的功能协调，以及若干基因的参与。并且，一些酶是由多个不同多肽链通过进一步聚合形成具有四维结构的催化活性单元（遗传信息从基因到酶的具体转化过程可以参见本书2.5节“分子生物学中心法则”）。Beadle和Tatum所揭示的基因仅是合成这个蛋白酶大分子的众多反应过程或基因组成中的基因之一。因此，“一个基因一个酶”的假说进一步改进为“一个基因一条多肽链”（one gene-one polypeptide）的假说。
　　1.2.2 DNA双螺旋结构
　　1953年，James Watson和Francis Crick在来自Rosalind Franklin命名为“Photo 51”DNA的X射线衍射谱图及Erwin Chargaff碱基配对等研究成果基础上提出了DNA双螺旋结构模型，以此作为现代分子生物学诞生的标志，开创了分子生物学发展的黄金时代。Watson在博士学习期间，主要研究X射线对噬菌体繁殖和发育的影响，并意识到噬菌体遗传物质组成及结构是阐明噬菌体复制机制的关键。在Cavendish实验室，Watson和与其专业形成互补的Crick相遇，展开了合作研究，并将目标锁定在揭示DNA分子结构上。在他们的合作研究中，Crick可以帮助Watson理解晶体学原理并为解释其结果提供必要信息，Watson可以为Crick提供细菌遗传学的发展动态和噬菌体研究的*新结果。Watson和Crick在1953年4月于Nature杂志发表了关于DNA双螺旋结构（图1.1）模型的论文。同期，Maurice Wilkins、Alexander Stokes和Herbert Wilson报道的DNA结晶X射线衍射实验数据从结构生物学的角度进一步证实了Watson和Crick所提出的DNA模型的合理性。时隔一个月（1953年5月），Watson和Crick再次在Nature杂志发文，从DNA双螺旋结构遗传学意义的角度报道了简单的DNA自我复制模型，合理解释了基因自我复制的过程，并指出突变是源于DNA中稀有的、短暂存在的碱基形式，进而导致复制过程的错误配对。这一结构模型解释了“基因自我复制与突变”的现象，即基因的基本属性问题。
　　图1.1 DNA双螺旋结构及配对碱基
　　1.2.3 遗传信息传递中心法则
　　DNA双螺旋结构的发现，确立了核酸作为遗传信息分子的物质基础，提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本原则，为认识核酸与蛋白质的关系及作用打下了*重要的基础。在此基础上，俄国物理学家George Gamow首次提出了遗传密码是核苷酸与氨基酸之间“连接者”的概念，但当时存在的问题是，如何寻找不同核苷酸序列和相同氨基酸序列之间的这一“连接者”。这一瓶颈问题很快被当时在美国工作的德国生物学家Johann Heinrich Matthaei和Marshall Nirenberg破解。1961年5月，Matthaei与Nirenberg通过向细菌提取物中加入人工合成的RNA（多聚尿嘧啶，poly-U）获得了由单一聚苯丙氨酸（Phe）聚合组成的肽链，实现了首个遗传密码子的破译，并从方法和策略上为遗传密码的全部破译找到了突破口。Nirenberg在已建立的体系上，进一步发现仅含有三个核苷酸的核酸分子足以固定到核糖体（当时称为“微粒体”）上，并使负载有特异氨基酸的tRNA结合在核糖体上。在此基础上，美国生物化学家Hargobind Khorana进一步建立了一种能合成具有特定碱基序列的多核苷酸分子的方法，从而加速了余下所有密码子的破译。
　　Crick在发现DNA双螺旋结构时，就提出了遗传信息“从DNA序列到RNA序列，然后再到蛋白质”这一分子生物学的“中心法则”（图1.2），并指出微粒体（核糖体）中的RNA对蛋白质合成的重要性。但这一时期，DNA-RNA-蛋白质3种大分子之间的联系或者分子生物学关系并未获得有力的实验证明，而解答这一瓶颈问题的关键在于法国科学家Francois Jacob和Jacques Monod证明了“遗传密码携带者—信使RNA（mRNA）”的存在。他们通过进一步的实验区分了rRNA与mRNA，证明了rRNA是一种稳定的核酸分子，具有rRNA的核糖体是合成蛋白质时的密码阅读器，mRNA控制着蛋白质的合成。
　　图1.2 分子生物学（遗传信息传递）中心法则
　　1.2.4 操纵子模型
　　通过对β-半乳糖苷酶诱导合成及“溶原化”细菌诱导裂解的试验研究，法国科学家Francois Jacob、Andre Lwoff和Jacques Monod提出了“操纵子（operon）模型”，从而解开微生物体内信息交换循环圈中的*后环节—基因表达的调控机制。在Lwoff指导下，Monod开展了大肠杆菌在同时加有葡萄糖及乳糖培养基中的乳糖代谢研究，结果表明乳糖的加入迅速诱导并增加β-半乳糖苷酶的合成。乳糖的分解和利用是由乳糖诱导合成的β-半乳糖苷酶的作用所引发的。同一时期，Lwoff研究组的Jacob利用高频重组菌株，在不同时间中止细菌的接合，将原噬菌体在细菌染色体上的整合位点进行了精准定位，并发现一旦噬菌体进入另一细菌细胞就能诱导产生新的噬菌体，但溶原性细菌对其他噬菌体的感染具有免疫力。这些实验结果都体现了相同的基因表达调控机制，为操纵子模型的提出提供了试验基础。在操纵子模型中，几个结构基因可以同时被一个调节基因控制，并组合在一起形成“操纵子”的结构，转录过程中，它们从“启动子”的序列开始转录成一条单一的mRNA分子（图1.3）。
　　1.2.5 聚合酶链反应（PCR）技术
　　分子微生物学研究通常需要大量DNA片段进行基因操作，远远高于微生物本身所能提供的DNA量。因此，众多分子微生物学研究需要依赖PCR技术对目标DNA片段进行大量扩增，然后再进行后续研究。PCR是通过特异引物、DNA聚合酶、4种碱基混合物在酶反应缓冲溶液中对目标DNA（或模板DNA）进行放大扩增的分子生物技术（图1.4）。Hargobind Khorana早在1979年就提出了核酸的生物体外扩增设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成某个基因片段”。但该设想直到1983年才由Kary Mullis实现技术开发。当时，生物化学博士出身的Mullis在美国Cetus生物技术公司供职，专门制备用作探针的寡聚核苷酸。一次偶然机会，Mullis想到如何利用极少量生物样本就能将DNA大分子的某个特定位置核苷酸片段进行扩增，即聚合酶链反应（PCR）技术。

目录
前言
1导论 1
1.1 分子微生物学概念 1
1.2 分子微生物学发展史 1
1.2.1 一个基因一个酶 3
1.2.2 DNA双螺旋结构 4
1.2.3 遗传信息传递中心法则 5
1.2.4 操纵子模型 6
1.2.5 聚合酶链反应（PCR）技术 6
1.2.6 DNA测序技术 8
1.2.7 设计人工蛋白 9
1.2.8 首个人造微生物 10
1.3 分子微生物学的基本研究内容 11
1.4 分子微生物学与环境关系 12
1.4.1 分子微生物学技术与环境检测 13
1.4.2 分子微生物学原理与各环境过程微生物响应机理研究 13
1.4.3 分子微生物学与新环境微生物技术开发 13
参考文献 13
2 微生物细胞大分子与分子生物学中心法则 15
2.1 微生物细胞大分子 15
2.1.1 微生物细胞化学组成 15
2.1.2 化学键与分子相互作用力 18
2.2 DNA 20
2.2.1 DNA分子结构 20
2.2.2 DNA分子与基因组 24
2.3 RNA 26
2.3.1 RNA分子组成与结构 26
2.3.2 RNA分类与功能 28
2.4 蛋白质 31
2.4.1 蛋白质组成 31
2.4.2 蛋白质结构与功能 34
2.4.3 蛋白质变性与复性 37
2.5 分子生物学中心法则 37
2.5.1 中心法则 38
2.5.2 DNA复制 38
2.5.3 DNA转录与RNA逆转录 43
2.5.4 蛋白质合成 46
2.5.5 分子生物学中心法则与环境应用 50
参考文献 51
3 原核微生物细胞结构与分子组成 52
3.1 细胞质膜 54
3.1.1 细胞质膜组成 55
3.1.2 细胞质膜结构 58
3.1.3 细胞质膜功能 60
3.2 细胞壁 72
3.2.1 细胞壁组成与结构 72
3.2.2 细胞壁功能 75
3.3 细胞内结构 76
3.3.1 核区 76
3.3.2 质粒 76
3.3.3 内含体 77
3.3.4 细胞其他组成部分 81
参考文献 84
4 原核微生物进化、系统发育与分类 85
4.1 遗传变异 85
4.1.1 基因突变 87
4.1.2 基因重组 93
4.1.3 基因转座 99
4.2 微生物进化与系统发育 102
4.2.1 微生物进化 102
4.2.2 系统发育 104
4.3 微生物系统分类学 110
4.3.1 微生物分类等级划分及命名规则 111
4.3.2 微生物分类方法 115
参考文献 122
5 微生物代谢 123
5.1 酶催化反应能学与酶促反应动力学 124
5.1.1 酶的组成与结构 124
5.1.2 酶催化反应能学 126
5.1.3 酶促反应动力学 128
5.2 氧化还原反应与电子传递链 132
5.2.1 氧化还原反应 132
5.2.2 电子传递链及传递过程中的能量转化 136
5.3 微生物代谢途径 140
5.3.1 发酵与呼吸 140
5.3.2 生物大分子的分解代谢 148
5.3.3 合成代谢 151
5.4 微生物生长繁殖 156
5.4.1 微生物营养类型 156
5.4.2 微生物生长 156
5.4.3 微生物系统的化学计量学与动力学 161
参考文献 165
6 病毒 166
6.1 病毒性质 166
6.1.1 病毒颗粒特征 166
6.1.2 病毒颗粒的化学组成 170
6.1.3 病毒分类与命名 173
6.2 病毒学研究基本方法 176
6.2.1 病毒分离与纯化 176
6.2.2 病毒测定 178
6.3 病毒表达、复制与感染 184
6.3.1 病毒生长与复制周期 184
6.3.2 病毒核酸复制与表达 186
6.3.3 病毒感染 188
6.4 病毒与宿主 195
6.4.1 病毒对宿主的影响 195
6.4.2 原核生物抗病毒感染 197
参考文献 204
7 环境分子生物技术 205
7.1 基于16S rRNA的PCR-克隆文库与测序分析 206
7.1.1 提取样品基因组DNA（genomic DNA） 207
7.1.2 PCR扩增目标片段DNA 208
7.1.3 PCR产物克隆 209
7.2 PCR-RFLP技术原理及应用 212
7.2.1 ARDRA 215
7.2.2 T-RFLP 216
7.2.3 AFLP 217
7.3 随机扩增多态性DNA（RAPD） 217
7.4 SSCP/DGGE/TGGE指纹技术 218
7.4.1 SSCP 219
7.4.2 DGGE/TGGE 220
7.5 荧光原位杂交 225
参考文献 228
8 微生物电子传递 230
8.1 微生物能量获取与吉布斯自由能 230
8.2 矿物形式及其氧化还原活性 234
8.2.1 含铁地表矿物 234
8.2.2 矿物质的氧化还原电位 236
8.3 微生物胞外电子传递 237
8.3.1 耦合有机物氧化与Fe（Ⅲ）还原的能量壁垒 238
8.3.2 直接电子传递 239
8.3.3 氧化还原中介体 247
8.3.4 直接电子传递与电子中介体介导电子传递 254
8.3.5 纳米导线 255
8.4 胞外电子传递意义 258
8.5 微生物电化学技术 258
8.5.1 微生物电化学技术总括 259
8.5.2 微生物燃料电池 261
8.5.3 总结和展望 266
参考文献 267