本书从代谢元件、代谢途径和代谢网络三个层次系统阐述了枯草芽孢杆菌细胞工厂的创制，在此基础上，举例介绍了枯草芽孢杆菌细胞工厂在N-乙酰氨基葡萄糖等重要功能食品原料生产中的应用：第1章简述了枯草芽孢杆菌的特点及其在系统生物学和代谢工程方面已有的进展；然后从代谢元件的挖掘与创新、代谢途径的设计与重构、代谢网络的组装与适配等方面论述了如何构建高版本枯草芽孢杆菌细胞工厂；第5～9章详细介绍了枯草芽孢杆菌细胞工厂在N-乙酰氨基葡萄糖、人乳寡糖、维生素K2、N-乙酰神经氨酸、磷脂酶D和几丁二糖脱乙酰酶合成中的应用。 本书是迄今为止国内外第一部全面介绍枯草芽孢杆菌细胞工厂的专著，可供发酵工程和合成生物学领域的研究人员参考，也可作为研究生教学参考用书。

第1章枯草芽孢杆菌概述
　　1.1枯草芽孢杆菌系统生物学研究
　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属中的模式菌，属于革兰氏阳性好氧细菌。相较于自然界中的许多其他微生物，B.subtilis的遗传背景清晰、基因操作工具成熟、无明显的密码子偏好性、胞外蛋白分泌能力强。与大肠杆菌相比，B.subtilis不分泌内毒素，己被美国食品药品监督管理局（FDA）认证是一般认为安全（generallyrecognized as safe，GRAS）微生物，可作为食品安全级别菌种。同时，B.subtilis不易受噬菌体污染，适合大规模发酵。基于以上诸多优异特性[2]，B.subtilis在基础研究和工业上得到广泛使用，其产品更是涉及食品、医药和饲料等多个领域。
　　微生物细胞工厂潜力的挖掘依赖于对调控网络的全局分析，这也是代谢通量调控的基础。枯草芽孢杆菌系统生物学包括转录组、蛋白质组和代谢组等方面的进展，使统计和计算模型分析多层组学成为可能。因此总结当前枯草芽孢杆菌系统生物学和代谢工程方面的进展，并探究如何获取组学数据或利用现有的组学数据加深对代谢的理解和实施代谢工程具有重要意义。
　　1.1.1多组学分析不同层次调控细胞内代谢流的作用
　　自然条件中，B.subtilis主要分布在土壤中，为了在变化的环境中生存，B.subtilis必须适应多变的条件。研究环境变化过程中微生物体内的多层调控及其相互作用，如基因表达、变构调控和翻译后调控，才能全面地阐明调控机制。
　　2012年，Buescher等利用统计和计算模型对多水平组学数据进行整合分析，其中包括转录组、蛋白质组、代谢组和启动子活性，以推断代谢调节的相互作用。该研究为B.subtilis的多层组学数据整合分析提供了范例，有助于我们理解环境变化过程中基因表达调控与代谢状态之间的相互作用。动态数据对于模拟B.subtilis在环境变化期间的代谢是非常重要的。该分析结果发现了数百种新的潜在相互作用，包括转录因子结合靶点、转录后调控及其他过程，有助于借助遗传和生化方法进一步探究相关调控机制[3]。
　　采用更先进的组学数据采集方法或优化组学数据检测方法，可以提高数据采集的覆盖率和准确性，这有助于进一步研究系统机制。为此，利用RNA测序、基于液相色谱/质谱的蛋白质组学和靶向代谢组学技术研究了B.subtilis的高质量、高覆盖率转录组、蛋白质组及内外代谢组[4-7]。例如，对B.subtilis的转录组分析表明，全局转录因子CodY参与了分层基因的表达调控[4]。此外，具有更高覆盖率和准确性的B.subtilis蛋白质组学研究表明，在一定胁迫条件下，大量细胞资源（可达总生物量的30%）被分配给伴侶蛋白和蛋白酶[5]。代谢组学数据有助于相关条件下的热力学和途径动力学建模[6]。对实验数据进行更深入的研究和整合，再通过统计分析和动力学建模可解析新的相互作用。
　　代谢流是多层调控事件综合作用的结果，直接反映代谢状态，为推测调控机制提供信息依据。研究不同调节层次的协调性及其对代谢流的贡献有助于阐明B.subtilis在波动环境中的反应[8，9]。将13C代谢通量分析和中心碳代谢转录水平分析相结合，研究B.subtilis在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中对有机酸添加的动态响应，结果表明转录水平与代谢通量的变化无关，因此翻译后调节是一个关键过程[9]。有研究表明，酶丰度和代谢浓度的变化都不能充分解释不同生长条件下代谢通量的变化，因此可以推测调控途径酶活性的机制，如转录后调控、翻译后调控和变构相互作用是影响途径酶活性的关键因素[8，9]。以上结论揭示了代谢工程并不总是仅仅通过改变转录水平的基因表达来改变靶向途径的代谢通量。因此，代谢工程不仅应关注转录调控，还应关注转录调控之外的机制，如转录后和翻译后调控及变构相互作用等。
　　1.1.2基因表达调控中的sRNA和反义RNA
　　小核糖核酸（sRNA）和反义RNA的调控发生在细菌转录后[1W2]。sRNA和反义RNA的系统鉴定己经通过差异RNA测序与DNA微阵列实现。通过转录组的全局定位，共鉴定出100个调控sRNA和424个反义RNA，这为阐明B.subtilis代谢的转录后调控机制奠定了基础[13，14]。
　　调控sRNA和反义RNA的研究揭示了其在代谢调节中的关键作用：①sRNA中SR1抑制精氨酸分解代谢相关基因操纵子rocABC和rocDEF的转录激活因子AhrC表达[15]；②铁保护反应sRNA中FsrA抑制中心代谢酶基因的表达，如乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶、二羧酸渗透酶和谷氨酸合酶[16，17]；③sRNA中RnaC/S1022与转录调节因子AbrB相互作用抑制细胞呈指数增长，从而产生生长异质性[18]；④SigB依赖型sRNA中S1136-S1134抑制rpsD表达，这导致乙醇胁迫下小核糖体（30S）亚基形成减少，可能是为了避免翻译错误[19]。
　　然而，与识别调控sRNA的大量研究相比，关注sRNA和反义RNA功能的研究很少。己鉴定出的sRNA和反义RNA还需进行系统功能注释，确定调节作用，才能应用在代谢工程的通量控制中。尽管可以通过一系列遗传和生化方法阐明特定sRNA的调节作用，但仍缺乏大规模的系统方法来进行调控sRNA和反义RNA的功能分析。
　　1.1.3翻译后调控和变构相互作用
　　1.翻译后调控
　　在B.subtilis中，*主要的翻译后修饰是磷酸化修饰，除此之外还有乙酰化和琥珀酰化翻译后修饰。蛋白激酶和蛋白磷酸酶的协同作用使B.subtilis中的磷酸化与去磷酸化成为可逆及动态的代谢调节手段。定量磷酸化蛋白质组学是识别体内磷酸化靶点的主要方法，该技术己被用于B.subtilis中，并鉴定了200多个涉及不同过程，如生物膜形成、脂肪酸代谢、中心碳代谢和转录调节等的磷酸化蛋白[21]。主要蛋白激酶的功能己经确定，包括蛋白精氨酸激酶McsB在热休克和氧化应激反应中的作用，蛋白酪氨酸激酶EpsB在细胞外基质调节中的作用，以及蛋白酪氨酸激酶PtkA在DNA合成和中心碳代谢中的调控作用。
　　虽然这些研究为磷酸化研究奠定了基础，但B.subtilis中磷酸化的机制研究仍落后于酿酒酵母。在B.subtilis中，特定位点磷酸化的体内功能未知且未得到验证。类似于*近酿酒酵母中磷酸化机制的研究，这些研究揭示了磷酸化在代谢通量控制中的关键作用。首先开发B.subtilis磷酸化靶标数据库，然后构建蛋白激酶和磷酸酶缺失突变体文库，为高通量鉴定磷酸化事件及其相互关系的研究奠定基础，*后基于代谢通量分析、代谢组学、统计学和计算模拟数据的解释，系统地预测其在生物体内的功能和验证磷酸化位点的特异性，可能有助于鉴定磷酸化在B.subtilis中的调控作用。
　　如上所述，深入理解磷酸化机制具有较大的挑战性。不过，*近的技术发展可能会为该机制的研究提供很大帮助。例如，基于成簇的有规律间隔的短回文重复（CRISPR）_Cas9的基因组编辑系统能够高效地实现基因敲除和定点突变，这会是一种构建菌株突变体以验证磷酸化、sRNA和预测变构功能的有效方法。例如，突变文库可用于研究磷酸化，高通量磷酸化蛋白质组学适用于研究个体基因扰动对磷酸化调节的体内影响[43]。
　　2.变构相互作用
　　与翻译后调控类似，变构相互作用直接介导各种酶的催化活性。在多重胁迫条件下，己在B.subtilis中证实了其直接调控酶活性的重要作用。目前的研究进展是：在体内，尚未发现B.subtilis的变构相互作用；在体外，蛋白-代谢物相互作用研究仍集中在蛋白和代谢物的单个组合方面。Shulman等利用动态代谢组学和快速代谢扰动期间的动力学建模，将大肠杆菌糖酵解中的变构相互作用系统化，成功实现多种变构相互作用的预测。
　　鉴定B.subtilis的变构相互作用仍存在以下挑战：①用于鉴定大肠杆菌或酿酒酵母变构相互作用的底物转移实验或基于蛋白质组的方法，必须针对B.subtilis进行重新设计和优化；②预测变构相互作用目前是通过体外酶分析来实现的，但体内变构相互作用验证技术的发展将提高验证的精度和速度；③由于缺乏识别变构激活剂和变构抑制剂结合位点的方法，铝丢失机制的揭示受到限制。
　　1.1.4中心代谢中的酶-酶相互作用
　　B.subtilis中蛋白-蛋白相互作用（PPI）也有相关研究，其中涉及中心碳代谢和其他细胞过程，如细胞分裂、孢子形成、细胞壁合成和DNA复制等，研究结果表明PPI无处不在，以及其在细胞分子机器组装中具有关键作用。此外，糖酵解酶与RNA降解酶（如Rny、RNaseJ1和RNaseJ2）的相互作用在RNA加工中起着重要作用。蛋白支架共定位代谢酶己被证明是通过产生近似酶模拟底物通道效应来提高靶生物分子产量的有效途径[51，52]。然而，以往酶-酶相互作用研究主要集中在结构相互作用上，针对功能相互作用的分析方法研究较少。因此，开发酶-酶相互作用的功能分析方法将有助于系统地理解这些相互作用的调节作用。
　　1.2枯草芽孢杆菌代谢调控元件与基因组改造工具开发
　　上述代谢研究为指导代谢工程提供了很多有用信息。代谢途径的构建和优化是通过静态或动态调控天然或异源酶的表达丰度来实现的，策略通常是改变调控元件，如基因拷贝数、启动子、核糖体结合序列（RBS）和终止密码子[53-55]。过去B.subtilis基因工程系统的综述主要集中在同源重组和基于各种选择性标记的基因组编辑系统[56]方面，在新表达系统的构建、合成sRNA装置的开发及用于代谢工程的CRISPR-Cas9基因组编辑系统方面缺乏相关进展描述。因此，本节我们主要关注新建立的表达系统、合成生物学装置及B.subtilis的基因组编辑系统。
　　1.2.1基因表达调控元件的开发
　　通过改变基因的表达调控元件，如启动子、RBS序列结构及其序列、起始密码子、终止密码子和质粒的拷贝数来改变途径酶的丰度，是平衡目标产物的合成与代谢途径和将代谢流从一个分支引入另一分支的常用方法。
　　新开发的表达调控系统和基因组编辑系统为进一步微调代谢途径提供了工具（表1-1）。5'非翻译区、RBS序列、RBS序列和起始密码子之间的间隔区序列及3'端序列对转录本稳定性的影响己被系统研究，结果显示这些序列改变都会影响酶的表达水平[62，63]。此外，还构建获得了一系列启动子文库，其强度达到三个数量级，可用于微调各种途径酶的表达。
　　1.2.2无诱导表达系统和芽孢杆菌遗传工具箱
　　开发一种无须诱导的化学表达系统对于简化发酵过程和降低生产成本具有重要的工业意义。*近Dormeyer等己建立了几种通过群体感应或低温诱导启动的表达系统[65]。为了在B.subtilis中构建食品级表达系统，Welsch等开发了一种基于工程化内源性II型毒素和抗毒素的表达系统，无须添加抗生素即可稳定表达基因[67]。
　　然而，以上系统仅能用于构建单基因表达系统，多基因通路的构建和优化需枯草芽孢杆菌细胞工厂创制及应用要多基因表达系统。为此，研究人员开发了芽孢杆菌遗传工具箱（BioBnck）。该工具箱是一系列不同启动子（强度为三个数量级）的兼容整合载体，用于调节多达三个表达盒，该表达系统为B.subtilis基因组装的标准化奠定了基础[68，69]。除了B.subtilis特异性表达系统外，跨物种表达系统的开发使优化的代谢途径或合成模块能够直接引入B.subtilis。
　　1.2.3合成RNA工具的开发
　　合成RNA工具的开发，包括sRNA和CRISPR-Cas9系统，将代谢调控范围从局部路径扩展到基因组规模。将RNA合成工具应用于芽孢杆菌属，提高了B.subtilis中尽乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的产量，提高了解淀粉芽孢杆菌中聚-Y-谷氨酸的产量，并增加了巨

目录
前言
第1章　枯草芽孢杆菌概述　1
1.1　枯草芽孢杆菌系统生物学研究　1
1.1.1　多组学分析不同层次调控细胞内代谢流的作用　1
1.1.2　基因表达调控中的sRNA和反义RNA　2
1.1.3　翻译后调控和变构相互作用　3
1.1.4　中心代谢中的酶-酶相互作用　4
1.2　枯草芽孢杆菌代谢调控元件与基因组改造工具开发　4
1.2.1　基因表达调控元件的开发　4
1.2.2　无诱导表达系统和芽孢杆菌遗传工具箱　5
1.2.3　合成RNA工具的开发　6
1.3　枯草芽孢杆菌代谢工程策略　6
1.3.1　模块化途径工程　6
1.3.2　限制代谢溢流、降低细胞裂解　7
1.3.3　高通量筛选　7
1.3.4　基因组缩减　7
1.3.5　辅因子工程引导的代谢优化　8
1.3.6　转运工程策略　8
1.4　枯草芽孢杆菌底盘细胞改造与构建　9
1.4.1　枯草芽孢杆菌底盘细胞的研究进展　9
1.4.2　枯草芽孢杆菌底盘细胞的应用　11
参考文献　13
第2章　枯草芽孢杆菌代谢元件的挖掘与创新　20
2.1　枯草芽孢杆菌CRISPR工具箱　20
2.1.1　CRISPR-Cas系统及其在基因编辑和表达调控中的应用　20
2.1.2　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑系统　22
2.1.3　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因表达调控系统　30
2.2　基于凝血酶-核酸适配体的代谢调控元件　36
2.2.1　体外结构转换型荧光生物传感器的构建与功能验证　38
2.2.2　基于DNA适配体的动态上调元件的设计、优化及应用　41
2.2.3　基于RNA适配体的动态下调元件的设计、优化及应用　46
参考文献　51
第3章　枯草芽孢杆菌代谢途径的设计与重构　57
3.1　基于稳态反应动力学模型的代谢途径瓶颈诊断　57
3.1.1　GlcNAc合成途径动力学模拟　57
3.1.2　潜在限速步骤存在时GlcNAc合成起始阶段动力学模拟　60
3.1.3　GlcNAc合成起始阶段的动力学测定　61
3.1.4　GlcNAc合成途径潜在限速步骤的分析及鉴定　62
3.1.5　阻断GlcNAc-6-P与GlcNAc之间无效循环对细胞生长和GlcNAc合成的影响　63
3.1.6　小结　65
3.2　基于氧化还原力平衡的代谢途径设计优化　66
3.2.1　辅因子工程　66
3.2.2　辅因子工程策略　68
3.3　基于非天然氨基酸的细胞生长与代谢途径调控　74
3.3.1　枯草芽孢杆菌中非天然氨基酸系统　75
3.3.2　非天然氨基酸系统用于细胞生长与代谢途径调控　76
3.3.3　非天然氨基酸系统用于生物封存　76
3.3.4　小结　78
3.4　基于功能膜微域的代谢途径区室组装　78
3.4.1　细菌中的功能膜微域　78
3.4.2　FMM在质膜上的分布及动力学行为　79
3.4.3　脚手架蛋白FloA和FloT的相关性分析　81
3.4.4　FMM-多酶复合体系统的设计和构建　84
3.4.5　动力学模型和代谢物动力学表征底物通道　87
3.4.6　FloT和SPFH结构域过表达对细胞生长的影响　89
3.4.7　FMM-多酶复合体与酶表达的相关性分析　91
3.4.8　工程菌的理化性质改造和活细胞检测　92
3.4.9　FMM改造对细胞生长的影响　95
3.4.10　基于FMM组分修饰的途径酶组装　96
参考文献　98
第4章　枯草芽孢杆菌代谢网络的组装与适配　102
4.1　基于基因回路的代谢网络自动全局调控　102
4.1.1　枯草芽孢杆菌中可编程生物传感器耦合CRISPRi基因回路　102
4.1.2　基于双功能丙酮酸响应基因回路的B.subtilis中心代谢全局控制　116
4.2　基于细胞群体感应的代谢网络系统　128
4.2.1　枯草芽孢杆菌群体感应系统概述　128
4.2.2　组氨酸激酶KinA改造对芽孢产生的影响　131
4.2.3　构建Spo0A-P调控启动子表达水平文库　133
4.2.4　受Spo0A-P激活调控启动子的构建　135
4.2.5　受Spo0A-P阻遏调控启动子的构建　136
4.2.6　Phr60-Rap60对Spo0A-P调控能力的影响　138
4.3　基于多模型驱动的代谢网络智能化调控　140
4.3.1　GSMM搭建及应用　141
4.3.2　基于GSMM驱动的代谢网络智能化调控　144
4.3.3　基于TRNM驱动的代谢网络智能化调控　146
4.3.4　基于多约束模型驱动的代谢网络智能化调控　148
4.3.5　展望　150
4.3.6　小结　151
参考文献　152
第5章　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成瓜乙酰氨基葡萄糖　158
5.1　中心碳代谢优化促进GlcNAc合成　159
5.1.1　阻断副产物乙偶姻溢流对GlcNAc合成的影响　161
5.1.2　阻断乙偶姻合成导致副产物乙酸溢流　162
5.1.3　添加碳酸钙和恒pH补料分批发酵对GlcNAc合成的影响　164
5.1.4　阻断副产物乙酸溢流对GlcNAc合成的影响　166
5.2　关键酶强化改变碳代谢流分布促进GlcNAc合成　168
5.2.1　N端融合标签提高关键酶CeGNA1表达　169
5.2.2　RBS优化对GlcNAc合成及关键酶CeGNA1表达的影响　172
5.2.3　整合表达关键酶EcGlmS促进碳代谢通量流向GlcNAc合成途径　173
5.2.4　关键酶EcGlmS5，端融合mRNA稳定子对GlcNAc发酵的影响　174
5.3　途径酶优化促进GlcNAc合成　177
5.3.1　丙酮酸积累对胞外pH和胞内pH稳态的影响　177
5.3.2　关键酶CeGNA1定向进化对GlcNAc合成的影响　178
5.3.3　脲酶表达对胞内pH及GlcNAc合成的影响　181
5.4　中心氮优化促进GlcNAc合成　184
5.4.1　阻断谷氨酸胞内降解途径对GlcNAc发酵的影响　185
5.4.2　异源表达谷氨酸脱氢酶对GlcNAc合成的影响　186
5.4.3　异源表达NADH依赖型谷氨酸合成酶对GlcNAc发酵的影响　187
5.5　展望　190
参考文献　191
第6章　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成人乳寡糖　197
6.1　人乳寡糖与人类健康　197
6.2　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成2'-岩藻糖基乳糖　199
6.2.1　2'-岩藻糖基乳糖及其生产简介　199
6.2.2　枯草芽孢杆菌中GDP-L-岩藻糖从头合成途径的构建　203
6.2.3　枯草芽孢杆菌中GDP-L-岩藻糖回补合成途径的构建　203
6.2.4　GDP-L-岩藻糖合成培养基的筛选　204
6.2.5　2'-岩藻糖基乳糖的合成与外源岩藻糖基化酶的筛选　205
6.2.6　胞内底物运输及辅因子合成的强化　207
6.2.7　内源乳糖转运蛋白强化、膜合成蛋白调控和途径酶融合　212
6.3　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成乳酰新四糖　218
6.3.1　乳酰-W-新四糖概述　218
6.3.2　枯草芽孢杆菌中LNnT异源合成途径的构建　221
6.3.3　模块化途径工程优化LNnT合成代谢网络　228
6.3.4　CRISPRi动态调控策略提高LNnT的合成　234
6.3.5　基于启动子工程的无质粒和芽孢LNnT合成菌株的构建　242
参考文献　258
第7章　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成维生素K2　262
7.1　维生素K2合成概述　263
7.1.1　七烯甲萘醌　263
7.1.2　传统提高MK-7合成的策略　266
7.1.3　菌株改造高效合成MK-7　268
7.2　增强前体供应提高MK-7的合成　269
7.2.1　增强甲萘醌典型合成途径对MK-7合成和细胞生长的影响　271
7.2.2　增强分支酸合成途径对MK-7合成和细胞生长的影响　273
7.2.3　增强MEP途径对MK-7合成和细胞生长的影响　274
7.2.4　关键基因menA对MK-7合成的影响　276
7.3　动态调控MK-7合成途径及发酵放大　278
7.3.1　群体感应系统调控MK-7的合成　279
7.3.2　在5L生物反应器中发酵合成MK-7　281
7.3.3　在15L生物反应器中发酵合成MK-7　282
7.3.4　在3 t生物反应器中发酵合成MK-7　283
7.4　比较转录组分析限制MK-7合成的因素　284
7.4.1　生物膜的形成对MK-7合成的影响　285
7.4.2　比较转录组学分析基因表达差异　286
7.4.3　在B subtilis168中过表达差异基因验证其对MK-7合成的影响　291
7.4.4　在BS20中过表达差异基因验证其对MK-7合成的影响　292
7.4.5　电子传递链对MK-7合成的影响　294
7.4.6　摇瓶验证信号转导与电子转移对MK-7合成的影响　297
7.4.7　15L发酵罐验证信号转导与电子传递对MK-7合成的影响　297
参考文献　300
第8章　枯草芽孢杆菌细胞工厂合成乙酰神经氨酸　304
8.1尽乙酰神经氨酸合成途径的构建和模块化优化　305
8.1.1　NeuAc合成途径的构建　305
8.1.2　GlcNAc和PEP模块化途径工程的设计与构建　307
8.1.3　GlcNAc和PEP模块化途径工程对NeuAc合成的影响　309
8.1.4　中心代谢途径改造提高葡萄糖向NeuAc的转化率　310
8.1.5　优化ytsJ基因表达水平提高苹果酸向NeuAc的转化率　310
8.1.6　小结　313
8.2　尽乙酰神经氨酸合成途径热力学瓶颈和限速步骤的解除　314
8.2.1　NeuAc合成途径热力学瓶颈分析　314
8.2.2　通过关键酶自组装和途径替换解除NeuAc合成热力学瓶颈　315
8.2.3　不同表达水平NeuAc合成途径关键酶验证解析限速步骤　318
8.2.4　基于NeuAc响应元件的NeuB定向进化系统的构建　319
8.2.5　通过NeuB定向进化和不同来源高催化活性酶替换缓解NeuAc合成途径限速步骤的影响　322
8.2.6　小结　323
8.3　尽乙酰神经氨酸合成途径所产生细胞代谢压力的解析和解除　324
8.3.1　强化NeuC途径对细胞生长和NeuAc合成的影响　324
8.3.2　不同表达水平NeuAc合成途径关键酶对细胞生长和NeuAc合成的影响　325
8.3.3　不同强度三条NeuAc合成途径复合对NeuAc合成效率的影响　328
8.3.4　小结　330
8.4　磷酸烯醇丙酮酸高效供给系统的构建和优化　331
8.4.1　苹果酸供给PEP系统的构建与优化　331
8.4.2　葡萄酸供给PEP系统的构建与优化　332
8.4.3　葡萄糖酸响应元件的构建与优化　334
8.4.