遗传篇
1 RNA-seq辅助诊断的黏多糖贮积症Ⅱ型
汤婕，李牛，王剑
（上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心遗传分子诊断科）
【案例介绍】
患者，男，3岁10个月，身高2625px，体重22kg，无头痛，无视物模糊，无多饮、多尿等不适，最初以“分泌性中耳炎，腺样体肥大”收治入院。主诉：手指伸不直，听力障碍（50dB），中耳炎。医生怀疑黏多糖贮积症（MPS）。既往有左侧慢性分泌性中耳炎及左侧咽鼓管功能不良史，曾行中耳炎置管、咽鼓管扩张术，腺样体已切除，睡眠轻度打呼噜。体格检查：神志清醒，特殊面容，体形匀称，视力尚可，有蒙古斑，心律齐，无心脏杂音，双肺（–），肝脾肿大，关节僵硬，腰椎L4向前滑脱，克氏征阴性，巴氏征阴性，四肢肌张力正常，爪形手。
辅助检查：①脑磁共振（MR）检查示血管周围间隙增宽，两侧顶叶白质异常信号，脑室扩大；②心脏超声左室明显增大；③尿糖胺聚糖（GAG）检测（+）；④艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（I2S酶）活性（+）：0nmol/（h mL）；⑤IDS基因一代测序（Sanger测序）（–）；⑥RNA测序（RNA-seq）显示IDS基因表达转录本缺失8、9号外显子，且与基因EOLA1转录本发生融合。诊断为黏多糖贮积症Ⅱ型（MPSⅡ）。
【案例分析】
黏多糖贮积症Ⅱ型（MPS Ⅱ，也称为亨特综合征）是因编码I2S的IDS基因发生变异造成I2S酶缺陷，使分解不完全的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素大量贮积于全身各脏器和组织中而致病。MPSⅡ诊断需结合临床表现、影像学检查及多种检测结果对患儿进行综合诊断[1]，检测一般包括以下几项。①GAG检测：尿液检测判断黏多糖的积累情况。②I2S酶活性检查：对患者血浆、白细胞或皮肤成纤维细胞进行生化检测，是诊断的金标准（在进行酶学检查时需检测至少一个甚至多个硫酸酯酶，以排除其他硫酸酯酶缺乏症）。③基因检测：确定IDS基因致病变异以辅助临床诊断及遗传咨询。该病例临床表现符合MPSⅡ表型，GAG检测和I2S酶活性检测都呈阳性，但Sanger测序未发现IDS基因存在可疑的有害变异。查阅文献发现少数患者存在IDS和其同源假基因IDS2（IDSP1）基因组水平的复杂重排[2]，可能是该患儿的致病原因；另一方面，也不能排除IDS基因深部内含子变异影响剪接。考虑到这两种情况都会对IDS基因的转录产生影响，在与临床医生沟通后，决定采用RNA-seq（RNA sequencing）更直观地分析患者IDS基因转录水平的改变。
RNA-seq结果表明该病例的IDS基因表达水平显著低于正常对照（Log2FoldChange： –1.60282，校正后的P值：8.07×10–7），且IDS转录本存在异常剪切事件（表1-1），同时对病例的转录本进行组装后发现其IDS转录本缺失8号、9号外显子（图1-1）。此外，RNA-seq的融合基因检测结果也揭示了病例存在IDS-EOLA1（CXorf40A）融合转录本（表1-2）。
为验证RNA-seq数据的分析结果，设计了特异性引物，并采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）以检测患者cDNA的变化，验证结果表明，IDS基因转录本确实缺失8号、9号外显子，且证实了患者中存在IDS-EOLA1融合转录本，而健康个体中则不存在，这与RNA-seq分析结果一致（图1-2）。此外，患者的母亲没有融合转录本，这表明患者体内的变异是新发（de novo）的。
基于该例患儿IDS基因转录水平存在完整的8号和9号外显子缺失，而Sanger测序并未在基因组水平发现相应位置的剪接变异，我们推测该患儿IDS转录水平异常来源于基因组水平重排，实验室随即利用Lualdi等[2]开发的基于PCR的简便分析策略检测可能发生的重排。对患儿基因组DNA特定位置PCR扩增后行Sanger测序，结果发现该患儿存在IDS2-GAATC＞IDS-AGAGG重组位点变化（图1-3），证实IDS和IDS2之间发生了重排（A类）。

目录
遗传篇
1 RNA-seq辅助诊断的黏多糖贮积症Ⅱ型 3
2 TECTA基因同义变异导致常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋 9
3 罕见出血性病例 13
4 全外显子组测序技术鉴定“2+0”型脊髓性肌萎缩症家系 19
5 双基因变异导致的甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症 24
6 全外显子组测序技术结合体内外mRNA剪接实验协助轴后多指产前诊断 29
7 TOE1基因突变相关脑桥小脑发育不全7型 37
8 TOP3A基因突变导致进行性眼外肌麻痹伴线粒体DNA缺失 42
9 46，XX男性性反转综合征 47
10 12号染色体异源父源单亲二倍体导致MYF5基因纯合变异 52
11 无创产前基因检测20三体高风险胎儿20号染色体单亲二倍体 56
12 TBX6基因移码变异及其亚等位基因变异导致胎儿脊椎肋骨发育不全 62
13 单基因全长测序明确苯丙酮尿症新基因型 67
14 遗传自外祖父的X连锁肝糖原累积病诊断 72
15 染色体1q21拷贝数变异相关疾病的病因 77
16 RHDO分析在遗传性耳聋产前诊断中的应用 84
17 女性X连锁精神发育迟滞-低张面容综合征携带者的X染色体失活分析 88
18 胎儿游离DNA高通量测序技术检出胎儿RAF1基因变异 93
19 NGS检测遗传性主动脉疾病亲代嵌合突变 97
20 胎盘嵌合导致NIPT与CNV结果不一致 101
21 利用全外显子组测序技术对脑桥小脑发育不全7型家系遗传病因的研究 108
感染篇
22 数字PCR技术用于急性白血病治疗后EBV/CMV感染诊断及监测 115
23 多重PCR技术用于腺病毒感染诊断 120
24 紧密帚枝霉感染引起鼻脑型脑膜脑炎 124
25 全外显子组测序鉴别诊断不明原因呼吸系统反复感染性疾病 130
26 tNGS辅助诊疗肺炎支原体合并腺病毒感染重症肺炎 134
27 NGS用于粪类圆线虫病诊断 139
28 NGS辅助播散性肺炎合并眼内炎患者病原体检测 144
29 NGS对疑似脊柱结核病的纠正诊断 151
30 血液肿瘤移植后淋巴增殖性疾病 157
31 mNGS诊断神经系统脑膜炎奈瑟球菌感染 166
32 mNGS诊断鸟分枝杆菌肺炎 169
33 mNGS诊断狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎 173
34 mNGS检测发现革兰氏阴性专性厌氧菌感染所致脑脓肿 177
35 结核性脑膜炎合并布鲁菌脑膜脑炎诊断 181
36 多重数字PCR连续监测恶性疟阳性患者 185
37 mNGS诊断播散性诺卡菌病 191
38 mNGS诊断坏死梭杆菌侵袭性感染引起的勒米尔综合征 196
39 纳米孔测序用于脑水肿合并颅内感染诊断 200
40 鹦鹉热衣原体感染引起的重症肺炎 206
41 新型冠状病毒核酸检测室间比对符合率仅为60%的原因分析 211
42 快检阴性而普检阳性的新型冠状病毒感染 217
肿瘤篇
43 结肠癌KRAS基因检测：PCR与NGS检测结果为何不一致 227
44 MEF2D/BCL9基因阳性伴CD5+异常表达的急性前体B淋巴细胞白血病诊断 232
45 NGS用于BRCA2基因发生有害突变的胰腺癌诊断 237
46 EGFR T790M突变位点NGS阴性而数字PCR阳性的分析 242
47 粪便SDC2基因甲基化检测筛查结直肠癌 247
48 唾液具核梭杆菌阳性用于结直肠癌诊断 254
49 罕见BCR-ABL融合基因突变CML患者 257
50 微流控HPV检测系统辅助诊断喉乳头瘤 262
51 扩增子建库法阴性而杂交捕获建库法阳性的BRCA基因检测 266
52 NGS诊断BRCA2基因致病性突变携带者乳腺癌 271
53 NGS用于单倍体移植复发患者HLA杂合性缺失检测 275
54 多重荧光PCR-毛细管电泳法检测胃腺癌MSI异质性 279
55 杯口细胞增多伴NPM1、TET2、FLT3-ITD阳性急性粒细胞白血病未分化型诊断 287
56 极易漏诊的多发性骨髓瘤 292
57 结直肠癌术后复发患者Septin9基因甲基化实验阳性 297
药物基因篇
58 奥卡西平药物致使血小板急剧减少 303
59 索磷布韦/维帕他韦治疗慢性活动性丙型肝炎 309
60 乙肝核苷酸类似物多重耐药突变 315
61 SLCO1B1和ApoE基因检测指导临床调整用药 320
62 CYP2C19基因罕见突变体*3/*17 325