第1章免疫分析
1.1免疫概要
人体每天都会遇到大量外来毒性物质，它们会通过皮肤、消化系统、呼吸系统侵入人体。大多数入侵并没有对人体造成严重损害，这归功于人体的免疫系统。免疫系统的主要功能就是防止、防御外来物质对人体的伤害。免疫是指机体对自身物质和非己物质的识别，以及对非己物质的反应应答，在应答的过程中产生特异性抗体、特异性激活淋巴细胞。免疫反应（免疫应答）即免疫系统对非己物质刺激产生的一系列复杂过程。免疫的相关知识在免疫学专业书籍中有详尽的介绍[1-3]，为方便阅读后面的章节，本章概述免疫及免疫分析。
1.1.1抗原
能够刺激机体免疫系统产生免疫反应，与免疫反应产物发生特异性结合的物质，即为抗原（antigen）。自然界的许多物质都可以成为抗原，但并非所有外源物质都能成为抗原。抗原具有两种重要属性，免疫原性（immunogenicity）和免疫反应性（immunoreactivity）。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原。仅有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten）或不完全抗原。
免疫原性是抗原刺激免疫系统产生抗体或特异淋巴细胞的能力，是抗原的*重要性质。抗原能显示免疫原性的前提是抗原对机体具有异物性，也就是说对免疫系统而言抗原是非己物质。所谓异物性是机体胚系基因编码产物之外的所有物质，以及免疫细胞在发育中未曾接触过的物质。正常情况下，机体免疫系统不会对自身正常物质产生免疫应答，但当免疫系统异常或机体受到伤害刺激时，免疫系统将自身物质当作异物识别，诱发自身免疫应答。抗原能显示免疫原性还要求抗原具有一定的理化性质、化学组成和结构。分子量越大，结构越复杂，化学性质越稳定，免疫原性越强。抗原大多数是蛋白质，通常分子量都较大，一般在10kDa以上。
免疫反应性是指抗原与其刺激机体产生的免疫效应物（抗体或特异性淋巴细胞）特异性结合的能力。抗原和抗体的结合是免疫反应性的典型表现形式，它们的结合表现出高度的专一性，即抗原仅能与其诱导产生的抗体发生反应。抗原的特异性是由抗原决定簇或表位（epitope）决定的。抗原决定簇指抗原表面决定抗原特异性的化学基团及其空间结构，一个多肽表位由5～15个氨基酸残基组成，一个多糖表位由5～7个单糖组成，一个核酸半抗原表位由6～8个核苷酸残基组成。抗原与抗体结合的表位总数称为抗原结合价。有的半抗原只有一个表位，只能与一个抗体结合，为单价抗原；天然抗原分子表面常有多个相同或不同的表位，属于多价抗原。不同抗原之间可能含有相同的抗原表位，这种表位称为共同抗原表位。抗体除了与其相应抗原发生特异性结合之外，还可与含有共同抗原表位的其他抗原发生反应，称为交叉反应。特异性是免疫分析的基础，交叉反应影响免疫分析的准确性。
1.1.2抗体
B淋巴细胞经抗原激活后，增殖、分化为浆细胞。抗体（antibody）是浆细胞分泌的一类免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所有的抗体均是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。有些Ig仅是化学结构与抗体相似，但没有抗体活性。活性抗体能与相应抗原特异性结合。抗体在血清和组织液中，与抗原结合形成免疫复合体，通过中和、凝集、沉淀、补体激活和固定等机制阻断抗原破坏细胞的路径，灭活抗原。
Ig单体分子是由2条相同的重链（heavychain，H；450～550个氨基酸组成，分子量为50～70kDa）和2条相同的轻链（lightchain，L；由220个氨基酸组成，分子量为25kDa）通过二硫键连接而成的四肽链，呈“Y”形结构（图1-1）。肽链N端由100多个氨基酸组成，序列变化较大，称为可变区（variableregion，V区），是抗原结合部位。重链和轻链可变区分别以VH和VL表示。在VH和VL结构域中，各有3个氨基酸的组成排列变化频率极高的区域，称为高变区（HVR），这是Ig与抗原表位形成空间匹配的关键部位，也称为互补决定区（CDR）。V区以外的氨基酸组成和序列相对恒定称为恒定区（constant region，C区）。重链恒定区可以分为3～4个结构域，分别用CH1，CH2，CH3等表示。轻链恒定区只有一个结构域。CH1和CH2之间的区域称为铰链区，富含脯氨酸，易于发生形变，改变Ig构型，便于Ig暴露结合位点，适应与抗原分子不同距离的结合。两个重链的铰链区由二硫键相连。Fab部分为抗原结合片段。
抗体在临床诊断、免疫分析、疾病治疗中发挥着重要的作用。抗体质量的好坏直接影响免疫分析的效果。人工制备抗体是获得大量抗体的主要途径。按照制备方法，抗体可分为多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。
1.多克隆抗体（polyclonal antibody）
将抗原注入动物体内，体内多个B细胞被激活，产生的抗体进入血液。因为注入的抗原由多种抗原成分组成，含有多种表位。即使是纯蛋白抗原分子也含有多个抗原表位。机体针对多表位抗原免疫产生的抗体是混合抗体，具有高度异质性，称为多克隆抗体。同一个抗原表位，由不同B淋巴细胞产生的不同质抗体，也是多克隆抗体。含有多克隆抗体的免疫动物血清、恢复期患者或免疫接种人群血清，称为免疫血清或抗血清。
2.单克隆抗体（monoclonalantibody）
单克隆抗体是由一个B淋巴细胞分化、增生的浆细胞产生的针对单一抗原表位的抗体。单克隆抗体的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同。由于浆细胞寿命短，难以培养，K?hler和Milstein在1975年将小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，既有骨髓瘤细胞的无限增殖特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力。B细胞杂交瘤产生的抗体为单克隆抗体。单克隆抗体技术极大地推动了免疫学的发展，于1984年获得诺贝尔生理学或医学奖。
3.基因工程抗体
目前单克隆抗体多为鼠源性，用于人体可能会导致不良反应。借助基因工程技术，在基因水平对Ig分子突变、切合、拼接、修饰，能够制备出部分或完全人源化的新型抗体分子，如人-鼠双嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体等。基因工程抗体既保持了单克隆抗体均一性高、特异性强的优点，又克服了鼠源性的弊端，应用范围更加广泛。全人源抗体是抗体药物的发展方向。
1.1.3抗原-抗体的结合反应
抗原-抗体的结合是一种特异性的可逆化学反应，是免疫分析的基础。反应过程用质量作用定律描述：
（1-1）
式中，[Ag]为抗原浓度；[Ab]为抗体浓度；[Ag-Ab]为抗原-抗体复合物浓度；ka为结合速率常数，L/（mol?s），也作kon；kd为解离速率常数，s–1，也作koff。常见生物体系中，ka约在103～107L/（mol?s），kd约在10–6～10–1s–1。速率常数可以使用表面等离子体共振（SPR）测量。
当反应达到平衡时：
（1-2）
（1-3）
式中，Keq为平衡常数，即结合常数或亲和常数（Ka），L/mol；其倒数为解离常数Kd，mol/L。结合常数和解离常数均可以用来表征亲和力大小，结合常数越大或解离常数越小，亲和力越强，表示抗原-抗体结合的牢固程度越高。多数抗体的解离常数在10–9～10–6mol/L。解离常数为10–9mol/L的抗体可以视为高亲和抗体，解离常数为10–12mol/L的抗体是超高亲和抗体。亲和力高的抗体用于临床检测时，反应快、用量少、灵敏度高。亲和常数和解离常数可以通过测量速率常数进行计算，也可以通过毛细管电泳、免疫分析等技术测定。
1.2免疫分析概要
免疫分析法（immunoassay）是一种化学测量方法，利用抗原与抗体之间的特异性反应捕获研究体系中的待测分子，进而使用试剂使捕获到的待测分子产生信号进行定量分析。待测分子可以是抗原，也可以是抗体。由于研究体系中的其他干扰物一般不会发生免疫识别，免疫分析具有特异性高、灵敏度高的优点，在医学检测、生物制药、环境化学等领域广泛应用。
免疫分析*早由美国科学家Berson和Yalow在1959年建立[4]。为了检测血液中胰岛素含量，他们在胰岛素标准品上标记放射碘（131I），将标记标准品连同胰岛素抗体加入到样品中。标记131I的胰岛素与未标记的待测胰岛素竞争结合抗体。孵育完成后，用纸色谱分离结合抗体和未结合抗体的胰岛素，分别测量这两部分的放射性，根据放射强度实现胰岛素的定量。1977年Yalow因此获得诺贝尔生理学或医学奖。1968年Miles和Hales将放射元素标记在抗体而不是标记在抗原上实现单位点免疫分析[5]。1971年，瑞典科学家Perlmann发表了**篇酶联免疫吸附法（ELISA）的论文，用碱性磷酸酶而不是放射元素作为报告探针检测了IgG[6]。同一年，荷兰科学家Schuurs利用过氧化氢酶作为报告标签检测了尿液中绒毛膜促性腺激素含量，发明了酶免疫分析（EIA）技术[7]。这两篇文章是酶标记免疫分析的发端。1973年，Belanger**次报道了夹心免疫分析法用于甲胎蛋白检测[8]。此后，夹心结构的分析形式被广泛采用。1975年，K?hler和Milstein创立的杂交瘤技术可以大规模生产单克隆抗体，促进了免疫分析的快速发展[9]。他们也因此获得1984年诺贝尔生理学或医学奖。1976年，化学发光**次用于免疫分析标记[10]。化学发光也是商业化程度*高的免疫分析法，在医院检验科使用得*多。这些免疫分析的基础形态和必要条件具备后，免疫分析迅猛发展，在临床检测上广泛应用。近些年，免疫分析除了应用到不同的场景之外，免疫技术本身向着高灵敏和多组分分析发展。1992年Sano等将PCR技术引入免疫分析，以一段可扩增的DNA标记抗体，以PCR扩增DNA进行信号放大，实现血清中10–18mol的检测[11]。2010年美国Quanterix公司开发了单分子ELISA技术，实现了亚飞摩尔浓度的蛋白抗原检测，开启了数字免疫分析（digital immunoassay）的研究[12]。了解更详尽的免疫分析发展历史可以阅读相关文献[13-15]。
1.3免疫分析的类型
免疫分析经过60多年的发展，分析模式多种多样，分析类型层出不穷，而且仍有新的信号放大、信号检测策略不断产生。免疫分析的分类角度各不相同，按照是否需要分离步骤分为均相（homogeneous）免疫分析和非均相（heterogeneous）免疫分析；按照待测目标分子种类和数量分为单组分分析和多组分（multiplex）分析；按照是否标记报告分子分为标记免疫和非标记免疫；标记免疫又可以按照标记分子类型分为放射免疫、荧光免疫、酶免疫、化学发光免疫、电化学免疫、比色免疫、拉曼免疫、等离子体共振免疫、脂质体放大免疫等等；按照标记位置不同又可以分为标记在抗原上和标记在抗体上，标记在抗原上为竞争型免疫，标记在抗体上称为抗体免疫（immunometric）；按照形成免疫复合体的构型可分为单位点免疫和双位点免疫，双位点又称为夹心（sandwich）免疫分析；按照检测平台的不同可分为毛细管电泳免疫、微流控芯片免疫、侧向流免疫、流动注射免疫、质谱免疫等；按照信号处理方式可以分为宏观免疫分析和单分子免疫分析或数字免疫分析。上述分类之间又可以交叉重叠，互相借鉴，彼此融合。比如基于微流控芯片的多组分均相拉曼免疫分析，量子点标记的多组分均相数字免疫分析等。下面介绍一些重要而常用的免疫分析类型。
1.3.1非标记免疫和标记免疫
非标记免疫分析属于传统免疫分析技术，利用抗原-抗体结合后物理化学性质的变化进行抗原或抗体测定的方法，主要包括沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫浊度等。这一类分析方法相对简单，是免疫分析早期建立起来的方法，其中有些方法现在还在临床上使用。但是这些方法共同的问题就是灵敏度低，不适于定量检测。因此，开发了标记免疫分析技术。将能够产生放射性、光、电等各种可检测信号的物质连接到抗原或抗体上，称为标记。信号物又称标记物、标签分子、示踪分子。连接了标记物的抗体或抗原称为探针。根据探针的信号强度对抗原抗体进行定量。标记免疫技术大幅
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