第一章绪论
第一节病毒样颗粒的概念及特点
一、病毒样颗粒的概念
病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），广义上是指其在形态和粒子大小上与真正病毒粒子相同或相似；限于当时的研究水平，还无法进一步验证、分析其具体成分和特性，对这一类结构，统称为“病毒样颗粒”（Feller and Chopra，1968；Jokelainen et al.，1970）。目前，VLP多指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含有病毒核酸，俗称伪病毒颗粒或假病毒颗粒（Fuenmayor et al.，2017）。随着分子生物学技术的不断发展，利用非共价作用或共价作用修饰所获得的嵌合型 VLP，均属于病毒样颗粒的范畴。
二、病毒样颗粒的特点及优势
（1）VLP疫苗是近年来新出现的一种基因工程亚单位疫苗形式，其优点包括不含核酸，不能自主复制，安全性好，因此可成为更安全、更经济的候选疫苗。 VLP形式的亚单位疫苗可以避免活病毒来源的或灭活疫苗所导致的潜在危险性，如人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗、人乳头状瘤病毒（HPV）疫苗，因此，具有更高的安全性。
（2）与单个蛋白质或肽相比， VLP的构象表位与天然病毒更相似，因此，可以显著地提高免疫应答水平。由于其表面的结构分子高度重复， VLP能够通过有效地交联 B细胞上的特异性受体，在没有佐剂的情况下诱导强烈的 B细胞免疫应答（Chackerian et al.，2002）。VLP可以模拟病毒的天然结构而使构象依赖型抗原表位得以正确呈现，具有良好的免疫原性；与传统的亚单位疫苗相比，VLP能像真实病毒粒子一样进入细胞，从而诱导有效细胞免疫应答（Greenstone et al.，1998；Sedlik et al.，1997）。甚至可以在较低剂量的情况下，即可诱导较强的免疫应答水平，从而显著降低疫苗成本。
（3）在不影响 VLP结构的基础上，可以根据需要插入或删除某些氨基酸序列，对其进行人工改造，构建嵌合 VLP（Cuburu and Chackerian，2011；Kaufmann et al.，2001）。如果把自然病毒粒子中具有免疫抑制功能的特定蛋白分子剔除于 VLP组成之外，可以显著增强该类疫苗的免疫效力。可以为实现多价和 /或多种病毒抗原的同时免疫，构建多价或多联疫苗，实现一针多防的目的（Chu et al.，2016；Jennings and Bachmann，2008），如利用猪细小病毒 VP2蛋白与疟原虫 CS蛋白上的 CD8+T细胞表位共表达（Rodriguez et al.，2012），利用乙型肝炎核心抗原展示Ⅱ型登革热病毒的囊膜蛋白 E Ⅲ区（ED3）（Arora et al.，2012）等，构建嵌合 VLP。
（4）可以利用 VLP作为某些小分子或者药物递送的载体（Kim et al.，2019；Pretto and van Hest，2019；Zdanowicz and Chroboczek，2016），如基于载体递送病毒样颗粒 Caspase 8至乳腺癌细胞，可以诱导肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤生长（Ao et al.，2019）；另外，利用 VLP作为 DNA疫苗（Jin et al.，2007）或者 RNA递送的载体（Finbloom et al.，2018），可以提高 DNA疫苗的免疫效力或者用于基因治疗（Zhitnyuk et al.，2018）。
（5）VLP除了作为疫苗和递送载体外，还可用于研究病毒蛋白装配及分子之间相互作用机制的工具（Chambers et al.，1996；Sabapathy et al.，2019；Tsukamoto et al.，2007）。尤其适用于高致病性病原的相关研究，如埃博拉病毒（Silvestri et al.，2007）、流感病毒（Makarkov et al.，2017）等，研究过程中不依赖于高等级生物安全防护设施，具有较高的便利性。
（6）在传统疫苗生产过程中某些具有高致病性的病原（如口蹄疫、高致病性禽流感）需要高等级的生物安全防护设施，存在着病原逃逸和泄漏的风险，生产成本较高。但是在相关 VLP疫苗制备过程中，不需要操作病原，不需要高等级的生物安全防护设施，一次性投入成本不高。
三、病毒样颗粒的不足
（1）从某种程度上来说， VLP疫苗仍属于亚单位疫苗范畴，其分子量和蛋白质结构复杂程度低于天然病毒，所以其免疫原性通常会低于天然病毒。
（2）某些 VLP的衣壳蛋白需要翻译后修饰，需要真核表达系统进行 VLP的生产和制备，所以制造成本相对较高。另外，利用真核表达系统进行 VLP的生产和制备，通常需要较为复杂的纯化步骤，又增加了 VLP疫苗的生产制造成本。
（3）不同表达系统对于相同的 VLP的结构和生产过程都会造成一定的影响。Zhou等（2006）对在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）和多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）中产生的重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）进行了鉴定，所制备的抗原颗粒的分子量、大小和单体数均表现出显著差异。在 CHO细胞中，HBsAg颗粒的分子量为 4.9 kDa，粒径为 22.1 nm，更接近于天然病毒，同时单体平均数为 155个；酵母来源的抗原颗粒较小（分子量为 3.0 kDa，粒径为 18.1 nm），含有较少的单体（n=86）。因此证明，CHO细胞更适合于生产乙型肝炎病毒表面抗原，并推测其应具备更好的免疫原性。这些现象也要求在生产 VLP疫苗之前，需要对表达系统进行筛选，以此生成具有更好免疫原性的疫苗。
（4）VLP疫苗生产和制备需要复杂的蛋白质纯化及浓缩工艺。例如，实验证明， CHO中分离的重组 HBsAg颗粒含有糖基化和非糖基化两种形式（Zhou et al.，2006），为了达到疫苗抗原均质化的要求，必须进行下游蛋白质纯化和浓缩。而酵母来源的 HPV VLP由高度异质性的、大小分布不规则的 VLP组成，因此，也需要复杂的蛋白质纯化工艺来满足质量要求。另外，细胞内组装的 VLP可能含有宿主蛋白或 DNA等杂质。污染物的水平不同，可能具有不同的不良生物反应，因此需要进一步处理以满足生物制药产品的严格要求。此外， VLP本身可能与宿主细胞中的蛋白质结合，从而在一定程度上污染了 VLP的外部，也因此增加了下游加工的复杂性。
（5）尽管可以通过与其他病原体的优势抗原表位共表达，构建嵌合 VLP，但是外源抗原表位或者抗原肽的长度受到一定限制，否则会干扰或者破坏 VLP的空间构象（Pumpens et al.，1995）。另外，由于空间位置的限制，引入的外源抗原肽的正确折叠存在一定的障碍，降低了重组蛋白的活性或免疫效力。
（6）在生产制备具有复杂结构的 VLP时，制备产物的异质性较高，需要复杂的下游纯化工艺才能获得同质性较好的产品。例如，在昆虫细胞内共表达轮状病毒结构蛋白 VP2、VP6和 VP7（很少同时共表达 VP2、VP6、VP4和 VP7四种结构蛋白）构建具有三层结构的 VLP时（Istrate et al.，2008），通常同时存在有单层、双层和三层衣壳的 VLP（Vieira et al.，2005），通常需要较为复杂的纯化步骤去除细胞杂质、单层和双层 VLP，这极大地降低了目标产物的产量，并且增加了制备难度和成本（Mena et al.，2005；Peixoto et al.，2007；Roldao et al.，2012）。
第二节病毒样颗粒的分类
基于母本病毒的结构特征， VLP通常可以分为两大类：无囊膜 VLP和有囊膜 VLP。无囊膜 VLP通常由一个或多个衣壳蛋白自我组装而成，它们不包含任何宿主细胞成分。某些无囊膜病毒的一个衣壳蛋白单独表达即可自我装配成 VLP结构，如人乳头状瘤病毒的 L1蛋白（Harro et al.，2001；Hagensee et al.，1993）、猪细小病毒的 VP2蛋白（Gilbert et al.，2006）、猪圆环病毒的 ORF2蛋白（Wu et al.，2016）的单独表达即可以装配成与天然病毒较为相似的 VLP；而口蹄疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒等则需要多个结构蛋白的参与才能装配成 VLP结构。另外，尽管蓝舌病病毒、轮状病毒的 VP2蛋白就可以形成 VLP结构，但是中间层和昀外层衣壳蛋白的参与是形成生物学活性更好的 VLP所必需的。
相比于无囊膜 VLP，有囊膜 VLP的结构较为复杂，其包含来源于宿主细胞的细胞膜成分。囊膜成分覆盖于 VLP表面，表现出与天然病毒相似的结构和功能，包括人免疫缺陷病毒（Buonaguro et al.，2013；Delchambre et al.，1989；Gheysen et al.，1989）、流感病毒（Yamshchikov et al.，1995）、乙型肝炎病毒（McAleer et al.，1984）、丙型肝炎病毒（Baumert et al.，1998）、副黏病毒（Park et al.，2014）VLP等。
此外，在无囊膜 VLP和有囊膜 VLP的基础上，构建表达异源抗原表位的重组嵌合 VLP，常用于获得无法形成 VLP的特殊病毒衣壳蛋白或药物载体等（Chu et al.，2016； Li et al.，2016；Shen et al.，2013）。例如，利用对称模型结合计算机蛋白质 -蛋白质界面设计的方法，获得具有四面体和八面体对称结构的精确蛋白质组件，这种组件可携带病毒特异的衣壳蛋白或具有免疫优势的抗原蛋白。有报道称，研究人员通过计算机设计从自组装的三聚体构架获得二十面体纳米笼，并可嵌合如绿色荧光蛋白（GFP）等高分子量蛋白质且保持结构稳定，不仅提高了内部体积，而且扩展了嵌合型 VLP作为异源蛋白质递送系统的生物应用范围。
第三节病毒样颗粒的发展历程
一、病毒样颗粒技术的进展
获得 VLP的方法，可以根据非嵌合型和嵌合型来简单分类，对于非嵌合型的 VLP，主要直接将病原衣壳蛋白构建于表达载体，并在相应的真核或原核表达系统中组装获得，或者是在表达系统中表达出衣壳蛋白后，纯化蛋白并在缓冲液的环境中组装出 VLP，如目前应用的猪圆环病毒 VLP疫苗，以及国内已获得国家一类新兽药证书的口蹄疫病毒 VLP疫苗。但大多数病毒的衣壳蛋白或抗原蛋白必须通过不同的方式获得嵌合型 VLP，以保证获得比亚单位呈现更多构象表位的 VLP疫苗，嵌合的方式包括基因融合及利用 VLP上赖氨酸和抗原上半胱氨酸化学偶联的传统方式，也包括几种较新型的嵌合方式，如利用非共价作用的粘贴（stick）法；共价作用的非天然氨基酸生物正交点击（click）化学法和 spy tag/spy catcher自发异肽键分子黏合（glue）法。传统嵌合方法具有挑战性，特别是对于复杂的、带有多种翻译后修饰的全长抗原分子。就基因融合而言，外壳蛋白氨基酸的末端是昀需要弯曲的部分，因此与 VLP的稳定性密切相关，融合其他外壳蛋白氨基酸的末端可能会使 VLP不稳定。融合的外壳蛋白氨基酸末端伸入 VLP的内部则不利于诱导抗体产生。环形的衣壳蛋白亚基可以耐受插入一些短肽，但是在环形衣壳蛋白亚基中插入一个完整抗原蛋白通常会影响衣壳蛋白亚基和 /或蛋白质抗原的折叠。VLP的组装过程通常是亚稳态，基因融合方法可能会对 VLP的组装产生严重干扰。此外，抗原结构复杂、翻译修饰多样、构象多变、抗原序列容易变异等因素均导致基因融合方法很难有效推进。
新型嵌合方式获得 VLP的方法统称模块化 VLP组装，是指经过多个步骤生成基于 VLP的疫苗，特别是， VLP和抗原分别生成，然后偶联。与基因融合相比，模块化 VLP的组装增加了一个额外的步骤，因此在理论上
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