第1章 梁山慈竹离体培养再生体系与遗传转化体系的研究
竹藤资源是一种非常重要而独特的战略资源，我国竹产业已发展成为一个由资源培育、加工利用到出口贸易，再到竹林生态旅游的颇具活力和潜力的新兴产业，形成了现代竹产业链，2019年竹产业产值达3000亿元。随着竹子工业化利用的快速发展及人们生活水平的不断提高，对适合不同用途的良种/新品种的定向创制和选育提出了更新更高的要求。由于竹子遗传背景的复杂性和生物学的特殊性，采用杂交育种技术对其进行遗传改良极其困难，严重制约了满足不同需求的竹新品种/种质的创制进程，问题的关键在于缺乏用于离体诱变的大型经济用竹的离体培养再生体系和通过基因工程进行竹类植物遗传改良的遗传转化体系。梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）是我国西南地区重要的经济竹种，是丛生竹中耐瘠薄、耐寒较强的优良笋材两用竹，其纤维含量高，是制浆造纸的优良原料，但以往对梁山慈竹的研究主要集中在竹材解剖（方伟等，1998）、退耕还林（笪志祥等，2007）、纤维及造纸性能（张喜，1995）、遗传多样性（蒋瑶等，2008）等方面，对梁山慈竹离体培养再生体系与遗传转化体系的研究则未见报道，因此，对其开展研究具有十分重要的意义。
1.1 梁山慈竹离体培养再生体系的研究
竹子组织培养研究有助于竹子的快速繁殖、转基因研究、无性系变异筛选等技术的发展。1968年，Alexander 和 Rao首次开展竹子种胚的组织培养。1982年， Mehta 等以印度刺竹种子成熟胚为材料诱导出愈伤组织和再生植株，此后，相继出现大量竹类植物组织培养的报道。1985年，Rao等以牡竹成熟种子诱导形成再生植株。1986年，Yeh和 Chang用绿竹的花序以体细胞胚胎发生方式再生了植株，以吊丝球竹花序和花序衍生的组织进行组织培养再生了植株；1987年，又以麻竹种子诱导愈伤组织并再生植株。1990年，Tasy等报道了麻竹的花药组织培养，形成了愈伤组织和再生植株。1995年，Chang和 Lan以无激素培养1个月的吊丝球竹再生植株根的组织成功诱导愈伤组织并再生植株。
国内也有一些竹类植物组织培养的研究，如麻竹、金丝慈竹、马来甜龙竹、巨龙竹、孝顺竹等。例如，广东省林业科学研究院于1989年开始进行竹子离体快速繁殖技术的研究，20多年来，为开发我国丛生竹资源和推广优良品种，先后进行了20余种竹子的组织培养，包括麻竹、马来甜龙竹、绿竹、印度刺竹、黄竹和牡竹等，其中多数得到生根小植株，部分已投入工厂生产。但是大部分为株型小的观赏竹类，也未见用于造纸的大型丛生竹如慈竹、梁山慈竹的离体愈伤组织诱导与植株再生体系成功建立的报道。
国内外竹的组织培养采用的外植体主要是种子、胚、竹枝、侧嫩枝顶芽、茎节间组织、茎休眠芽、幼竹笋和花药花序等，培养基有 B5、MS、N6、White和 BM。不同基因型、培养基成分、激素类型和浓度及培养条件对植株诱导再生有影响。培养的途径有两种，一种是脱分化获得愈伤组织，再经过分化形成再生植株；另一种则是直接诱导芽，进一步生根获得小植株。竹的愈伤组织诱导及再生体系建立是竹遗传转化的基础和前提。
以往对竹离体培养的研究多集中在观赏竹类，而有关用于造纸的大型丛生竹离体愈伤组织诱导与植株再生体系成功建立的报道较少。本研究起始于2008年，以西南地区大型本土丛生竹—梁山慈竹种子成熟胚/茎节为材料，对其进行愈伤组织诱导与再生体系建立的研究，为纸浆用竹的遗传改良奠定基础。
1.1.1 材料
梁山慈竹种子（采自四川省泸州市）。
1.1.2 方法
1.培养基的配制及灭菌
本研究选取 MS和 WPM 2种基本培养基、2种激素配方，随机组合成4种培养基进行梁山慈竹愈伤组织的诱导（4种培养基分别命名为 MS1、MS2、WPM1和 WPM2，由于培养基的配方和培养方法已申请国家发明专利，在此不详细列出）。各培养基中分别加入相应激素，加蔗糖30g，于1L烧杯中，调节 pH至5.8，加入琼脂条7g后于电炉上熬至透明，分装于三角瓶中，封口后于高压灭菌锅内121℃灭菌20min。
2.外植体消毒与接种
将梁山慈竹种子用70%乙醇搓洗干净后于25℃无菌水中泡胀，浸泡约24h。在超净台内用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，0.1% HgCl2消毒30min，无菌水冲洗6次。消毒完毕的种子取胚接种于4种愈伤组织诱导培养基上。
3.愈伤组织诱导
种胚接种后，暗培养1周，取出放在光照下培养，23～25℃，每天辅助光照12h。每天观察记录愈伤组织诱导情况和生长情况，分别在3天、7天、15天统计愈伤组织诱导率。
4.植株再生与移栽
愈伤组织经过继代培养获得分化愈伤组织后，将其转至丛生芽诱导培养基，诱导丛生芽分化，待丛生芽长出后转至生根培养基中诱导生根。
将长势良好的竹苗取出，洗净根部培养基，移栽至营养钵中，放置在温室内，待竹苗适应土壤后移栽至大盆。
1.1.3 结果与分析
1.梁山慈竹种子愈伤组织的诱导
（1）种子消毒时间的确定
有活力的梁山慈竹种子经过浸泡之后能明显看出鼓起的胚，无活力的胚则仍然干瘪。挑选有活力的种子于超净台中，用0.1% HgCl2分别消毒10min、20min和30min后取胚接种于 MS1中，*终确定污染率分别为46.7%、30%和10%。因消毒时间过长毒害作用较大，外植体褐化死亡，故选择消毒条件为70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，0.1% HgCl2消毒30min，无菌水冲洗6次。
（2）愈伤组织诱导培养基的筛选
2种激素配方、2种基本培养基随机组合成4种愈伤诱导培养基，分别命名为 WPM1、WPM2、MS1和 MS2，暗培养3天个别胚开始启动，7天左右基本全部启动，脱分化形成愈伤组织。4种培养基与愈伤组织诱导情况见表1-1。
表1-1不同培养基上的愈伤组织诱导率
在 WPM1、MS1、WPM2和 MS24种培养基上，梁山慈竹种胚接种3天后均有膨大迹象，进入愈伤组织诱导的启动期，7天后基本形成愈伤组织，15天左右出愈率分别达到81.5%、82.8%、92.6%和96.0%。从激素配比来看，2号配方的 WPM2和 MS2愈伤组织诱导率明显高于1号配方的 WPM1和 MS1。由此可知，2号激素配方更有利于愈伤组织的发生与形成。从基本培养基来看， WPM培养基容易诱导芽和根，这在诱导初期不利于愈伤组织的生长和增殖， MS培养基则极少出现生根现象，且愈伤组织的长势快，状态良好。综合比较4种培养基， MS2为诱导梁山慈竹愈伤组织的*佳培养基。
（3）愈伤组织的诱导及分化
为记录梁山慈竹愈伤组织各时期的生长情况和形态，以及各类型愈伤组织产生的时间，以 MS2培养基中的愈伤组织为对象，观察记录梁山慈竹愈伤组织的生长情况。
愈伤组织接种3天后开始膨大，进入愈伤组织诱导启动期（图1-1B），15天左右基本形成愈伤组织，主要性状为白色至乳白色，外表光滑较透明，质地外松内硬（图1-1C）。在15～30天，进入愈伤组织分裂期，愈伤组织除体积变大外，在形态和性状上变化不大，有少部分胚诱导的愈伤组织开始褐化，这与接种胚的质量有关（图1-1D）。
图1-1 梁山慈竹种子成熟胚愈伤组织诱导与分化
A.梁山慈竹成熟种子；B.诱导时期的愈伤组织；C.分裂时期的愈伤组织；D.褐化愈伤组织；
E.带紫红色斑点的愈伤组织；F.分化时期的愈伤组织
30天后，愈伤组织进入分化期，大部分愈伤组织体积迅速变大，长出疏松易碎的颗粒状愈伤组织，乳白色至黄绿色，非水渍状，质地均匀较硬，增殖能力强（图1-1F）；少部分愈伤组织未能进入分化期，仍然为白色或乳白色，外表光滑，水渍状，质地外松内硬，不易分离，随继代时间延长，逐渐褐化死亡（图1-1D）；另外，还发现有一些愈伤组织在分化过程中，表面出现紫红色斑点（图1-1E），这类愈伤组织分化前整体颜色为白色至浅黄色，呈干爽松散的颗粒状，增殖能力极强，且不易褐化，在分化阶段出现紫红色斑点，*终分化出白化苗。白化苗转至生根培养基同样诱导出根（图1-2D），但本研究中的白化苗发生率极低，仅为0.02%。
图1-2 愈伤组织的器官发生与植株再生
A.丛生芽和丛生根同时发生的再生植株；B.浅绿色丛生芽；C.再生小植株；D.由紫红色斑点的愈伤组织分化出白化苗；E.愈伤组织先分化出丛生根再分化出芽；F、G.愈伤组织先分化出芽，然后在下方诱导生根
2.梁山慈竹植株再生
（1）愈伤组织的器官发生和植株再生
接种30天左右，处于分化时期的愈伤组织开始器官发生，出现不同类型：第一种类型是深绿色丛生芽和丛生根同时发生，且再生小植株不易分株（图1-2A）；第二种类型是深绿色丛生芽和丛生根同时发生，发生后易将植株分开，且可以成活（图1-2C）；第三种类型为分化出浅绿色丛生芽，诱导生根后，再生小植株移栽失绿死亡（图1-2B）；第四种类型为先分化出丛生根，在其上方分化出丛生芽，形成小植株（图1-2E）；第五种类型是先分化出深绿色丛生芽，转入生根培养基上可进一步在其下方诱导出丛生根，形成小植株（图1-2F和图1-2G）。梁山慈竹愈伤组织植株再生过程绝大多数以第二种和第五种类型为主。
（2）芽诱导生根
分化愈伤组织直接诱导出芽后，将其转至生根培养基，15天左右可诱导出茁壮的根系（图1-3A）。一种类型为丛生芽的下方诱导出呈辐射状生长的多条茁壮不定根，在初始不定根上再长出侧根（图1-3B和图1-3C）；另一种类型为芽的下方长出茁壮的多条不定根，在初始不定根上无侧根发生（图1-3D和图1-3E）。
图1-3 芽诱导生根
A.经过生根诱导的再生植株；B.辐射状的不定根系；C.初始不定根上长出侧根；D、E.初始不定根上无侧根长出
3.梁山慈竹无菌苗愈伤组织的诱导及植株再生
在超净台内剪取梁山慈竹无菌苗幼嫩枝条、嫩芽或嫩叶，接种于愈伤诱导培养基 MS2上，观察并统计愈伤组织生长情况，结果如表1-2所示。
表1-2 不同外植体的愈伤组织诱导率和性状
本研究选取无菌苗的嫩芽、带节嫩茎段、不带节嫩茎段、嫩叶和叶鞘5种外植体接种于愈伤组织诱导培养基 MS2中进行预实验，结果表明，嫩叶、叶鞘和不带节嫩茎段接种1周左右开始黄化，然后逐渐萎蔫死亡，完全不形成愈伤组织；只
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