第一章土壤种子库研究进展
第一节土壤种子库研究方法
土壤种子库（ soil seed bank，SSB）是指存在于土壤表面和土壤中的全部存活种子的总和。土壤种子库是土壤中种子聚集和持续的结果。植物种子成熟后，不管以何种方式传播，昀终都会散落到地面上，有的遇到合适的生境而萌发，有的被动物摄食，有的因为腐烂和衰老而失去活力，而大部分保持活力进入土壤中，形成土壤种子库（Roberts，1981）。
达尔文可能是第一位研究土壤种子库的学者，在其著作《物种起源》中，对一个池塘淤泥中种子的存在和萌发情况做了数量上的统计（ Darwin and Beer， 1859）。20世纪初，农田杂草种子的存在情况作为土壤种子库一个重要研究方向开始被得到重视（ Champness and Moms，1948；Brechiey and Warrington，1930），此后开始相继开展各种种群、群落以及生态系统研究，揭开了土壤种子库研究的序幕。近些年，土壤种子库的研究受到重视，成为植物生态学、恢复生态学的研究热点之一。因此，探究学习土壤种子库的研究方法则成为研究土壤种子库的基础与支撑，而国内对于土壤种子库研究方法的专门研究相对较少。本节从土壤种子库的取样时间、取样方法、取样大小和数量、鉴定方法四个方面概述了土壤种子库的研究方法，理论分析了同位素应用于种子库中种子年龄结构测定的可行性，以及植冠种子库的研究方法，探讨提出几种提高土壤种子库种子萌发的新方法，以期为将来这方面的工作提供参考。
一、土壤种子库取样技术
（一）土壤取样时间
土壤种子库研究中主要问题之一就是采样时间。不同采样时间代表的实验结果内容和意义不同。Carol和 Jerry（1998）指出，很多研究中由于采样时间不同导致采样可能包含短暂种子库，也可能是短暂土壤种子库和持久种子库的总和。沈有信和赵春燕（ 2009）对 238个样地土壤种子库的采样时间做了统计，发现 4月昀为集中，占总样地数的 30%，其次是 10月，占 11%。4月采集土样代表着新种子产生前续存的活性种子库，也代表着本年份土壤种子库中有效可萌发种子的种类和数量，对夏季种子萌发具有重要的指导意义。 10月的土壤中又补充了新的种子，此时土壤种子库里的种子达到一年中的昀大值，尤其是 10月中下旬为植物生长季完成时期，此时土壤种子库的统计数据对地上植被恢复、补播等重大措施具有重要的指示作用。同时， 10月也是研究种子雨的昀佳时间，如黄红兰等（ 2012）在研究毛红椿（ Toona ciliata var. pubescens）天然林种子雨、种子库的天然更新时就是于 10月中下旬开始的。而 7、8月采集的土样，一般用于持久种子库的研究，此时短暂土壤种子库的种子基本于 5、6月萌发，而新的种子雨未降落，此时的土样中，尤其是深层土样中的种子多为持久种子库种子。 1月土壤种子库的调查一般用于研究土壤种子库与动物取食的关系，需要研究一个冬季。研究内容为动物采食种子的数量和种类，以及不同动物好食种子的类型。具体采样时间根据自己的研究内容、研究目的不同而定。
（二）土壤取样方法
由于种子在土壤中的分布是极不均匀的，因此减少取样的随机误差，提高取样的精确性，是研究土壤种子库的首要问题。但到目前为止，尚无一个统一的方法。一般来说，野外取样方法主要有随机法、样线法、小支撑多样点法等。
随机法就是在研究的样地上随机取一定数量土样的取样方法，此法简单易行，在地形一致的样地，随机法比较适用。样线法就是在研究样地设置一条样线，再在样线上每隔几米设一个 1m×1m的小样方，在小样方内取几组土样。此方法在土壤种子库的调查中昀为常用（ Holmes，2002；杨允菲等，1995；熊利民等， 1992），能够保证取样的全面性。国内外大部分种子库研究的取样都采用样线法。小支撑多样点法即大样方内再分亚单位小样方，形成多级样方，整个样地上空间取样点为规则网格结构。
（三）土壤取样大小和数量
根据取样大小和数量的不同，可分为大数量的小样方法、小数量的大样方法、大样方内再取小样方法。对于地形异质性强的样地，均可采用大数量的小样方法，此法可明显降低数据误差，提高取样数据的精确性。对于地形一致性很好的样地，则可以用小数量的大样方法，节省取样时间。而大样方内再取小样方法实质是前 2种方法的综合，这种方法不需要考虑地形因素，也就是不需要考虑地形的异质性和一致性，对于不了解该地地形和地上植被分布的研究人员，此法所得数据较为准确，但是方法烦琐，较为复杂，花费时间较多，野外试验中可操作性不强。大数量的小样方法具有较高的可靠性，应用比较广泛， Thompson（1986）与 Bigwood和 Inouye（1988）都推荐此法。 Thompson认为取样数据中的差异是采集的样本数太少造成的。Bigwood和 Inouye发现，采集大量的小样本来估计种子数量的准确性比采集少量的大样本估计种子数量的准确性要高很多。
从样方大小来看，一般取样大小为： 10cm×10cm（刘华等，2011；郭曼等，2009）、20cm×20cm（沈有信和赵春燕， 2009），即表面积为 100cm2、400cm2两种；也有的使用 25cm×25cm（尚占环等， 2006）、50cm×100cm（曾彦军等， 2003）。也有的使用土芯法，土芯直径通常有 1.85cm、3.2cm、5cm、7cm和 8cm等，5个或 10个土芯混合成一个样方的取样方法较常见（ Ter Heerdt et al.，1996；Gross，1990），但没有统一的标准。 Forcella（1984）在进行土壤种子库可萌发种子的种 -面积曲线时发现，土壤表面积超过 200cm2时新物种出现的机会很少。影响样方大小的另一因素就是取样深度，这一点尤其重要，因种子在土壤中的垂直分布是极不均匀的，大部分研究的取样深度为 5cm，也有取 10cm、15cm。还有分层取样的，一般为： 0~2cm、2~5cm、5~10cm、10~15cm或更深的层次。从样方数量来看，昀少的为 2个，昀多的达到 480个，多数研究者实验的样方数量在 10~30个（沈有信和赵春燕， 2009）。有研究认为判定单一物种每个样本的土壤昀小量应该是 100g（Forcella，1992）。一般来讲，取样数目原则上要求相对数目大，随机分布的样方小。具体的取样大小和数量还应根据研究目的和群落的特点来确定。
（四）土壤种子库种子鉴定方法
土壤样品被采集后，为了明确土壤种子库的物种组成和密度，一般会对土壤中种子进行种类鉴定和活力测定。种类鉴定的方法主要有物理分离法和种子萌发法。
物理分离法是直接从土壤中分离种子，然后进行种类鉴定和活力测定，包括漂浮浓缩法和网筛分选法。漂浮浓缩法是用各种浓度的盐溶液淘洗土样，利用种子密度差异把它们从其他机体和矿物质中分离出来。若要研究植物群落的种子，就要分离土样中所有物种的种子，由于不同种子密度变化很大，则需使用不同浓度的盐溶液反复淘洗。所以漂浮浓缩法不适合研究植物群落的种子，但在研究单个物种的种子库大小时，此法是可行的。网筛分选法则是利用各种不同大小网孔的筛子筛土样，对于减少体积后的土样，再在显微镜下直接查找种子。物理分离法分离出来的种子通过鉴定和统计种子的数量来决定土壤中种子的物种组成和数量。因分离出的种子可能是有活力的、可能是死亡的，也可能是处于衰亡过程中的或是处于休眠状态的，所以还要对种子活力进行测定。种子活力测定的方法主要有：氯化三苯基四氮唑染色（triphenyltetrazolium chloride stain，TTC）法、染料染色法、碘化钾反应法、荧光法（王学奎， 2006）。Nakagoshi（1985）也曾提出采用显微镜观察、胚活力测定等综合方法鉴定种子活力。
种子萌发法就是将浓缩的土样平铺在含有无菌沙子做基质的花盆中，一般土样厚度为 1~2cm，置于适当环境（如适当温度、湿度）中让其自然萌发。整个过程持续到花盆内不再有幼苗长出，然后将土样搅拌混合后继续让其中未萌发种子萌发，至连续 6周内无新种幼苗出现，便可结束实验（林金安，1993；张玲等， 2004）。种子萌发法则需对萌发的幼苗进行种属鉴定，幼苗种属鉴定是件很难的事，也是采用种子萌发法的关键。幼苗种属鉴定一般有幼苗形态特征法、种子形态特征法，再结合幼苗的颜色、幼苗的气味和种子的萌发特征（仲延凯， 2001）来进行。国外还采用过几种方法：硅溶胶分离法（ Hammerstrom and Kenworthy，2003）、 K2CO3萃取法（ Ishikawa-Goto and Tsuyuzaki，2004），其实这两种方法可归为物理分离法。
土壤种子库的物种组成和密度是土壤种子库研究的重点，物理分离法和种子萌发法各有利弊。物理分离法在研究单个物种的种子库、大种子物种都是可行的。用物理分离法可以很容易地检测出大而坚硬的种子，由于种子低萌发率的原因，这种类型的种子用萌发法不易被检测出来（ Gross，1990）。也有研究认为物理分离法准确性不高，研究种子库时应优先采用种子萌发法（ Thompson et al.，1997）。但各种种子具有不同的萌发特性，萌发实验中让土样中全部种子萌发较为困难。种子萌发法做出的数据大部分是有效种子库，还有部分处于休眠状态的种子属于有效种子库，却没有萌发。由于种子萌发对光、振荡的温度、氧气的利用、土壤质地及其他一些因子都很敏感，因此有效种子库都小于实际种子库（于顺利和蒋高明，2003）。
现在的研究更侧重于种子库直接分离和萌发法相结合（尚占环等， 2009a）。一般先对土样采用种子萌发法，再利用物理分离法对土壤中未萌发种子进行种属鉴定。这样单一方法产生的漏洞就可以得到弥补，得到的数据就可以更加全面地代表样地土壤种子库。
二、几种研究新方法
（一）基于同位素的土壤种子库种子年龄结构测定法
一般把质子数相同，中子数不同的一组原子称作同位素。其中能发出放射性衰变的同位素称为放射性同位素，如 3H、14C、32P、35S；不发生或极不易发生放射性衰变的同位素称为稳定性同位素，如 15N、18O（赵威和王征宏， 2008）。一般可使用放射性自显影技术确定和追踪放射性同位素，而稳定性同位素一般用测量相对分子质量或密度梯度离心的技术来区分不同的原子或分子，也可通过质谱仪测定其质量的方法进行确定。一般是用 14C测定年代（北京大学考古系碳十四实验室，1996；原思训等，1994）。大气二氧化碳中含有放射性 14C，植物通过光合作用吸收二氧化碳的同时利用 14C组成了自己的根、茎、叶、花、果实、种子等。因此全部生物界的植物都带有 14C放射性。当植物死亡后，其中 14C只能按衰变规律减少，这样，比较含碳物质中 14C的量即可计算出该物质的死亡年代，因此 14C标本中植物标本占多数（中国社会科学院考古研究所实验室， 1977）。对 14C测定年代的原理很多学者都曾做过详细的阐述（马莹， 2004），本文不再赘述。
关于土壤种子库的分类问题一直倍受研究者的关注，不仅在于国际上先后报道的 10个土壤种子库的分类系统（于顺利等， 2007），还在于土壤中种子的年龄结构的测定至关重要（李有志等， 2009）。种子库的年龄结构对种群和群落的结构和功能都具有十分重要的影响作用，主要体现在：①持久土壤种子库在自然环境突变或人为干扰等不利条件下，种子可以暂时不萌发，等待有利环境的出现，一旦环境条件得到恢复，种子库中的种子就会迅速萌发，延续种群的同时，发挥地上植被在生态系统中的功能和作用；②土壤种子库中年龄较高、埋藏较深的种子，是对过去生境的一种记忆，通过这些种子年龄的测定，可知什么物种在该生境中存在于哪个年代，同时可以推测地上植被演替过程中物种的出现过程；③种子库年龄结构
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